保健食品的微生物限度檢驗方法驗證淺析省公開課一等獎全國示范課微課金獎課件

保健食品微生物程度

檢驗方法驗證淺析

第1頁引言伴隨國民生活水平提升，人們對生活質(zhì)量也有了較高要求，防病于未然健康意識逐步被人們所重視，保健食品隨之成為人們脫離亞健康路徑之一。我國保健食品概念是1996年《保健食品管理方法》中“標明含有特定保健功效食品。即適宜于特定人群食用，含有調(diào)整機體功效，不以治療疾病為目標食品”。含有三種屬性：食品屬性；功效屬性(含有特定功效)；非藥品屬性。然而劣質(zhì)保健食品不但不能提升人們生活質(zhì)量，甚至威脅生命安全，因而保健食品安全評價及質(zhì)量檢驗是確保人們使用合格產(chǎn)品前提。第2頁保健食品質(zhì)量安全包含兩方面內(nèi)容：不以傳統(tǒng)食品為載體保健食品含有其特有安全問題。以傳統(tǒng)食品為載體，要考慮對應食品安全問題，如以植物為起源傳統(tǒng)食品當考慮農(nóng)殘、植物生長刺激素等；以動物為起源則應考慮抗生素、激素等。但同時作為保健食品特有質(zhì)量安全問題，還須高度關注保健食品中加入化學藥品（如違法添加芬氟拉明、麻黃素或速尿減肥產(chǎn)品；又如一些“補品”檢出了枸櫞酸西地那非，即偉哥主成份），各種功效成份/提取物內(nèi)源性毒物安全（如中草藥毒性及長久服用安全性評價），新資源、新技術、功效性安全，進口保健食品，偽劣保健食品，非法添加物檢驗等問題。第3頁鑒于保健食品于近年來暴露出一些質(zhì)量問題，中檢所和藥檢處統(tǒng)一布署，擴大我所檢驗范圍，開展對保健食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗工作，微生物程度作為食品藥品必檢項目，顯示其基礎安全主要性。我室于、06年進行了保健食品衛(wèi)生微生物學程度檢驗及方法學驗證試驗工作，完成了30各種購置樣品試檢驗任務，以及幾個注冊品種檢驗，包括口服液、片劑、膠囊、茶劑等常見保健食品類型，結合食品國家標準和藥典探討保健食品檢驗方法及可行性，現(xiàn)對有檢驗情況匯報以下，供檢驗部門參考。第4頁摘要我所按中國藥典版微生物程度法及方法學驗證法，對32種保健食品進行方法學驗證，結果表明其中15個品種（活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)膠囊、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊、全蟲草膠囊、再高鐵兒童成長口服液、血爾口服液、瞳神牌輕亮、養(yǎng)顏鹿胎粉、夢玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、二月紅牌紅潤片）分別對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有抑菌作用，染菌回收率均低于70%。結果說明：1、采取GB/T4789.1~4789.31~食品微生物程度檢驗法不能真實反應產(chǎn)品質(zhì)量，因而不宜采??；2、應分別采取培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法進行方法學驗證。3、微生物程度方法學驗證必要性。第5頁關鍵詞方法學驗證、微生物程度、回收率、保健食品質(zhì)量。第6頁一、試驗目標確認對保健品進行微生物程度檢驗時，所采取細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢驗方法是否適合于該保健品微生物程度檢驗。第7頁樣品（1）天元甘露低聚果糖液0701云南綠色生物工程有限企業(yè)（2）維生素E（加州熊）040902濟南生命力生物科技有限企業(yè)（3）海王金樽040712深圳市海王健康科技發(fā)展有限企業(yè)（4）神奇壽樂牌排鉛沖劑040210常州市紅太陽工程有限企業(yè)（5）蓋中蓋高鈣片1207哈藥集團制藥六廠（6）龍希膳食纖維膠囊0718湖北恩施宏業(yè)魔芋開發(fā)有限責任企業(yè)（7）紫薇卵磷脂膠囊1119清華紫光（集團）總企業(yè)（8）吾老七羊胎美容濃縮液04092701浙江蘅州市吾老七保健品有限企業(yè)（9）腦輕松膠囊1207香港康富來國際企業(yè)有限企業(yè)（10）江中亮嗓胖大海0822云南綠生物工程有限企業(yè)（11）江中活謂素得而樂膠囊1206廣州藍鑰匙海洋生物工程有限企業(yè)（12）忘不了3A腦營養(yǎng)1107山東禹王制藥有限企業(yè)第8頁（13）瞳神牌輕亮04030101北京輕爾特科技開發(fā)中心（14）再高鐵兒童成長膠囊0920廣州市紅虹生物科技有限企業(yè)（15）血爾口服液0006香港康富來國際企業(yè)有限企業(yè)（16）金舒通膠囊0601-05武漢名實醫(yī)藥科技有限責任企業(yè)（17）仙牌靈芝茶0112四川仙牌靈芝集團有限企業(yè)（18）事輕松膠囊1026武漢靜悟綠色保健研究所（19）養(yǎng)顏鹿胎粉040606廣東廣濟堂醫(yī)藥保健品有限企業(yè)（20）老君舒壓茶1218成都物華生物制品有限企業(yè)（21）夢玉膠囊 0102濟南生命生物科技有限企業(yè)（22）心態(tài)好（天一美樂寧片）031201北京樂寧科技有限責任企業(yè)（23）華濟堂牌護肝靈膠囊0517美國德全高科技藥業(yè)05210525第9頁（24）前烈立舒膠囊QLS05222香港奧美制藥廠（25）二月紅牌紅潤片042425050中天(上海)營養(yǎng)食品有限企業(yè)（26）紳寧寶膠囊0220、0225香港康恩堂制藥有限企業(yè)（27）博士倫博視康牌葉黃素片1515、1525、1535德國博士曼大藥廠（28）全蟲草膠囊210西藏天知生物科技開發(fā)有限企業(yè)（29）覺父膠囊0307、0327香港奧美制藥廠（30）苦瓜精華素片3117、3500美國GSL科技有限企業(yè)（31）寧烈寧膠囊0428、0509香港奧美制藥廠（32）富威牌劍影膠囊021333北京富威生物科技開發(fā)企業(yè)第10頁二、培養(yǎng)基膽鹽乳糖增菌液批號：040324玫瑰紅鈉瓊脂批號：050316營養(yǎng)瓊脂批號：050310營養(yǎng)肉湯批號：041010改良馬丁瓊脂批號：050520改良馬丁瓊脂液體批號：040302曙紅亞甲藍瓊脂批號：040413葡萄糖肉浸液肉湯批號：040902EMB批號：040413麥康凱批號：050608血營養(yǎng)瓊脂批號：050310沙門、志賀菌屬瓊脂批號：050121胰酪胨大豆肉湯批號：050422DHL批號：0501274-甲基傘形酮葡萄糖苷(MUG)050127GN批號：040224四硫酸鈉煌綠增菌液TTB批號：040413以上培養(yǎng)基均由中國藥品生物制品檢定所提供，另由本室本室自行配制膽鹽乳糖增菌液（小倒管）10ml。第11頁三、菌種枯草桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(F)44102]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]弗氏志賀菌（Shigellaflexneri）[CMCC(F)51573]乙型溶血性鏈球菌（β－Hemolyticstreptococcus）[CMCC(F)32210]沙門氏菌（Salmonellaparatyphi）[CMCC(B)50094]第12頁四、方法驗證1、菌液制備：（1）取經(jīng)37℃培養(yǎng)18-24小時，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、乙型溶血性鏈球菌、福氏痢疾肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至10-5~10-7為50~100CFU/ml，做活菌計數(shù)備用。（2）取經(jīng)25℃培養(yǎng)18~24小時白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至10-5為50~100CFU/ml，做活菌計數(shù)備用。（3）取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3~5ml鹽水洗下霉菌孢子，吸收出菌液，用標準比濁管比濁，與濁度相當后，取1ml+9ml鹽水=10-1，逐管10倍稀釋為10-4約50~100CFU/ml，做活菌計數(shù)備用。第13頁菌液檢驗

（1）取上述金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌、乙型溶血型鏈球菌、福氏痢疾菌、沙門菌10-5~10-7稀釋液各1ml，用45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿，30～35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)，應約為50~100cfu/ml。（2）取上述白色念珠菌10-5~10-6稀釋液及上述黑曲霉菌10-4孢子懸液各1ml，用45℃琥紅瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿，23～28℃培養(yǎng),逐日觀察計數(shù)，應約為50~100cfu/ml。第14頁供試液制備稱取樣品10g，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液100ml濃度均為1：10供試液。第15頁細菌、酵母菌及霉菌方法學驗證（1）常規(guī)法：采取加1：10供試液1ml，分他人工接種上述5種陽性代表試驗菌株，50~100CFU/ml，再加15~20ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置要求溫度培養(yǎng)24~48小時觀察結果細菌計數(shù)，測定回收率結果見表2。（2）培養(yǎng)基稀釋法：采取加0.5ml、0.2ml、0.1ml/皿供試液，人工接種上述敏感試驗菌株，再加15~20ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置要求溫度培養(yǎng)24~48小時觀察結果細菌計數(shù)，測定回收率。結果見表3。（3）薄膜過濾法：分別取不一樣品種1：10供試液取上清夜1ml加入濾器中、用0.1%蛋白胨氯化鈉稀釋液沖洗300ml/濾器再加要求敏感菌株沖洗后、取出濾膜貼要求培養(yǎng)基培養(yǎng)24~72小時觀察結果見表4。第16頁回收率測定：（1）試驗組：分別取不一樣品種1：10供試液1ml、50~100CFU/ml試驗菌株同時加入平皿中，馬上傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置要求溫度培養(yǎng)24~72小時觀察結果。薄膜過濾法以最終一次沖洗液加入試驗菌。（2）活菌組：測定每一菌株加試驗菌數(shù)見表1（3）供試液對照：測定供試品本底菌數(shù)（略）（4）稀釋劑對照組。第17頁回收率計算按以下公式計算試驗組加菌回收率：第18頁（三）、控制菌檢驗方法學驗證當建立藥品微生物檢驗法時，應進行控制菌方法學驗證，以確認所采取方法適合于該藥品控制菌檢驗（1）試驗組取1：10供試液，接入100ml/瓶5瓶膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基和3瓶亞碲酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基中，（10ml供試液/瓶）其中1瓶接種大腸埃希菌、福氏痢疾、沙門菌供試液瓶、稀釋劑對照組瓶；其中1瓶接種乙型溶血性鏈球菌、供試液瓶、置35培養(yǎng)經(jīng)24~48小時結果見表5。第19頁（2）陰性菌對照組a取金黃色葡萄球菌50~100cfu/ml，接種膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，置35培養(yǎng)經(jīng)24~48小時，陰性菌對照菌組為陰性（未生長）。b取大腸埃希菌50~100cfu/ml，接種亞酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基中置35培養(yǎng)經(jīng)24~48小時，陰性菌對照菌組為陰性（未生長）。第20頁五、結果菌落計數(shù)

表1菌落計數(shù)試驗次數(shù)金葡菌10-6枯草桿菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大腸桿菌10-6126、2617、1336、35128、129134、151283、8616、2526、2494、9839、44378、8698、96100、110120、12660、62469、49100、102100、110128、13025、20第21頁表2微生物程度檢驗法驗證常規(guī)法接種陽性菌株回收率（%）序號供試品金葡菌枯草桿菌大腸桿菌白色念珠菌黑曲霉菌1天元甘露低聚果糖液100.080.0100.094.2100.02維生素E（加州熊）97.070.795.2100.0100.03海王金樽100.070.775.9100.090.64神奇壽樂牌排鉛沖劑98.895.187.9100.0100.05蓋中蓋高鈣片100.0100.087.799.187.46龍希膳食纖維膠囊100.0100.0100.094.282.97紫薇卵磷脂膠囊100.0100.0100.0100.095.48吾老七羊胎美容濃縮液100.0100.0100.087.6100.09腦輕松膠囊100.0100.0100.079.1100.010江中亮嗓胖大海100.0100.073.896.5100.011活謂素得而樂膠囊55.1100.0100.085.2100.012忘不了3A腦營養(yǎng)0.0100.093.373.3100.013瞳神牌輕亮88.80.090.4100.0100.014再高鐵童少兒成長口服液100.046.381.9100.0100.015血爾口服液73.20.091.898.1100.0第22頁序號供試品金葡菌枯草桿菌大腸桿菌白色念珠菌黑曲霉菌16金舒通膠囊100.036.792.3100.095.417仙牌靈芝茶74.630.080.8100.096.518事輕松膠囊100.053.376.988.790.519養(yǎng)顏鹿胎粉85.20.061.4100.085.420老舒君壓茶85.7100.095.994.287.621夢玉膠囊0.014.086.5100.0100.022心態(tài)好（天一美樂寧片）100.085.2100.0100.091.823華濟堂牌護肝靈膠囊0.0//100.0100.024前烈立舒膠囊100.0100.071.4100.0100.025二月紅牌紅潤片52.5100.076.477.680.226紳寧寶膠囊0.00.0100.0100.089.727博士倫博視康牌葉黃素片0.00.00.085.286.528全蟲草膠囊77.765.488.2100.0100.029覺父膠囊30苦瓜精華素片73.4100.0100.095.572.231寧烈寧膠囊32富威牌劍影膠囊100.0100.066.287.872.9第23頁注：23~31為年檢驗，控制菌全部按國家標準GB/T4789.1~4789.31~食品衛(wèi)生微生物學檢驗方法進行檢驗從表2結果中能夠看出：32個品種分別接種5株代表菌，有16個品種回收率均超出70%，可采取常規(guī)方法進行測定；另16個品種（活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)、再高鐵兒童成長口服液、血爾口服液、瞳神牌輕亮、養(yǎng)顏鹿胎粉、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、夢玉膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊、二月紅牌紅潤片、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、全蟲草膠囊）分別對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌有抑菌作用，染菌回收率%均低于70%，應分別采取培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法進行方法學驗證。第24頁供試品金葡菌10-6枯草桿菌10-5大腸桿菌10-6忘不了3A腦營養(yǎng)82.4常規(guī)法已經(jīng)過常規(guī)法已經(jīng)過活謂素得而樂膠囊82.6常規(guī)法已經(jīng)過常規(guī)法已經(jīng)過再高鐵兒童成長口服液常規(guī)法已經(jīng)過40.6常規(guī)法已經(jīng)過養(yǎng)顏鹿胎粉常規(guī)法已經(jīng)過38.2/金舒通膠囊常規(guī)法已經(jīng)過70.2常規(guī)法已經(jīng)過仙牌靈芝茶常規(guī)法已經(jīng)過70.0常規(guī)法已經(jīng)過事輕松膠囊常規(guī)法已經(jīng)過100.0常規(guī)法已經(jīng)過華濟堂牌護肝靈膠囊82.975.997二月紅牌紅潤片0.5ml/皿100.00.0、11.1常規(guī)法已經(jīng)過全蟲草膠囊0.5ml/皿常規(guī)法已經(jīng)過85.9、92.6常規(guī)法已經(jīng)過富威牌劍影膠囊0.5ml/皿常規(guī)法已經(jīng)過常規(guī)法已經(jīng)過100.0表3回收率小于70％品種采取培養(yǎng)基稀釋法

（0.2-0.5ml/皿）回收率（%）

第25頁從表3中結果看出活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊等6個品種采取培養(yǎng)基稀釋法0.2ml/皿，全蟲草膠囊和富威牌劍影膠囊采取培養(yǎng)基稀釋法0.5ml/皿，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌回收率均超出70%，使細菌正常生長，可采取培養(yǎng)基稀釋法測定。再高鐵兒童成長口服液，養(yǎng)顏鹿胎粉經(jīng)培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）測定，對枯草桿菌回收率仍低于70%；二月紅牌紅潤片采取稀釋法進行檢測（0.5ml/皿）枯草桿菌回收率不穩(wěn)定，均低于70%，故用薄膜過濾法進行方法學驗證。而對回收率很低品種，血爾口服液、瞳神牌輕亮膠囊、夢玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片，可直接采取薄膜過濾法進行方法學驗證。第26頁表1—6結果

1．32個品種其中天元甘露低聚果糖液、維生素E（加州熊）、海王金樽、神奇壽樂牌排鉛沖劑、新蓋中蓋高鈣片、龍希膳食纖維膠囊、紫薇卵磷脂膠囊、吾老七羊胎美容濃縮液、腦輕松膠囊、江中亮嗓胖大海、老舒君壓茶、前烈立舒膠囊、覺父膠囊、苦瓜精華素片、寧烈寧膠等16個品種可采取常規(guī)法進行試驗。2.活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)膠囊、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊、全蟲草膠囊、富威牌劍影膠囊8個品種細菌數(shù)可采取培養(yǎng)基稀釋法測定。3.血爾口服液、養(yǎng)顏鹿胎粉、再高鐵童少兒成長膠囊、瞳神牌輕亮、夢玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片和二月紅牌紅潤片8個品種細菌數(shù)可采取薄膜過濾法測定。第27頁4.年所檢22個品種沒有測定沙門菌，對于其它控制菌無抑菌活性，可采取常規(guī)法進行測定。年所檢10個品種其控制菌檢驗，按照國家標準GB/T4789.1~4789.31~食品衛(wèi)生微生物學檢驗方法測定了沙門菌，除華濟堂牌護肝靈膠囊采取培養(yǎng)基稀釋法進行測定，前烈立舒膠囊、二月紅牌紅潤片、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、全蟲草膠囊、覺父膠囊、苦瓜精華素片、寧烈寧膠囊富威牌劍影膠囊，對霉菌、控制菌均無抑菌活性，均可采取常規(guī)法進行測定。第28頁檢驗結果分析

當前，保健食品按國家標準GB/T4789.1~4789.31~食品衛(wèi)生微生物學檢驗方法進行檢驗，該標準中僅提供了普通檢驗方法，并沒有提供方法驗證內(nèi)容和要求。而保健食品中一些成份和添加劑使用往往對微生物生長含有抑制作用，僅依據(jù)國家標準（GB/T4789.1~478