T-CVMA 165-2024 禽白血病病毒磁微?；瘜W發(fā)光檢測方法

T/CVMA165—2024禽白血病病毒磁微?；瘜W發(fā)光檢測方法Magneticparticlechemiluminescencemethodfordetectionofavian2024-5-23發(fā)布2024-5-23實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I12規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范T/CVMA32禽白血病病毒抗原化學發(fā)光免疫分激發(fā)液excitationflu4符號和縮略語2MES溶液：4-嗎啉乙磺酸溶液（4-MorpholineethanesulfonicaMEST溶液：4-嗎啉乙磺酸吐溫溶液（4-MorpholineEthylsulfonicAcidTweenPBST：磷酸鹽吐溫溶液（PhosphaNHS溶液：N-羥基丁二酰亞胺溶液（N-hydroxysuccinimidesolution）育洗滌后，加入激發(fā)液A和激發(fā)液B；在堿性條件下，吖啶酯分子的發(fā)射光強度達到最大，通過測量的7.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。3取全蛋，破碎后取蛋清，置-18℃以下凍融一次，用塑料吸頭吸取蛋清直接進行8.1.2泄殖腔拭子取泄殖腔拭子時，將拭子伸入泄殖腔轉3圈并沾取少量糞便；用棉簽于待檢雞只泄殖腔取樣后，放入lmL樣品稀釋液中，置-18℃以下凍融1次，恢復室溫（15℃~25℃)后，劇烈振蕩1min，擠出棉簽中的液體，棄棉簽。將液體于2℃~8℃下，以12,000r/min離心1min，取上清直接進行檢測。用棉簽取待檢雞只胎糞，放入1mL稀釋液中，置-18℃以下凍融1次，恢復室溫（15℃~25℃)后，劇烈震蕩1min，擠出棉簽中的液體，棄棉簽。液體在2℃~8℃下，以12,000r/min離心1min，取上清直樣品若在一周內檢測，可置2℃~8℃條件下保存。若超過一周檢測，應置于-80℃以下冷凍保存。運輸時注意冷藏。采集的樣品可用冰袋或保溫桶加冰密封等方式運輸，在24h內完樣品與陰性對照發(fā)光值之比﹤0.2，樣品判定為禽白血病病毒抗45A.1磁珠偶聯(lián)物的制備A.1.1抗體處理取500μL抗禽白血病病毒P27蛋白單抗（濃度1mg/mL裝入透析袋中溶液（PBS）中，室溫（15℃~25℃)透析4h。A.1.2洗滌羧基球取200μL羧基磁珠（濃度50mg/mL）到離心管中，固定到磁力架上進行磁分離），），A.1.3羧基球活化），再加入125μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽），室溫（15℃~25℃)反應30min。反應結束后，磁分離，移除上清，用MES磁分離洗滌2次。A.1.4偶聯(lián)抗體補加MEST至總體積1mL，搖勻后固定在混勻器上室溫反應4h以上。反應結束后，磁分離，移除上清，加入1mL的封閉液，振蕩分散均勻后，固定在混勻器上反應4h。A.1.6保存重懸偶聯(lián)后的磁珠，2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.2磁珠溶液的制備將得到禽白血病病毒抗體磁珠偶聯(lián)物用PBST按照1:100稀釋，加入0.02%Proclin-300混勻后，無菌分裝，2℃~8℃保存。6取500μL抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體（濃度2mg/mL），裝入透析袋中，置于透析液PBS中，室溫（15℃~25℃)透析4h。取出透析后的抗體溶液，加入潔凈玻璃瓶中，再將吖啶酯溶液（濃度5.0mmoL溶液中，避光，室溫反應2h。反應后入10%（m/V）賴氨酸封閉，室溫反應1h。將標記抗體溶液，裝入透析袋內，置于pH值7.4的0.05moL/LPBS透析液中，室溫（15℃~25℃)B.1.5保存將得到的禽白血病病毒標記單克隆抗體用PBS緩沖液（0.01加入0.02%Proclin-300混勻后經(jīng)0.22μm濾器過濾，無菌分裝，于2℃~8℃保存。7氯化鉀0.2g，加入800mL純化水攪拌溶解，再加純化水定容至1,000mL，經(jīng)0.22μm過濾，置2℃~8℃37±2℃溫箱倒置培養(yǎng)12h～16h。挑取單菌落轉接于200mL含50μg/mL氨芐霉素37±2℃、在200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12h左右至OD600nm達到0.6h～0.8h，加入終濃度為0.5mmoL/L的pH值7.2）重懸沉淀，通過超聲波破碎儀破碎菌體后，在2℃~8℃下，以12,000r/min離心10min，取上清。采用鎳離子梯度親和層析法進行純化獲得純化的禽白血病病毒p27蛋白。8稱取十二水合磷酸氫二鈉72.5g、磷酸二氫鉀5g、氯化鈉200g、氯化鉀5g，加入700mL雙蒸水加熱攪拌溶解，再加入12.5mL的吐溫-20，而后加雙蒸水定容至1,000用蒸餾水或去離子水25倍稀釋。1份25倍濃縮洗滌液加24份蒸餾水。例如：40mL2稱取2.9g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、8g氯化鈉、量取200mL純化水，加入37%濃鹽酸溶液8.33mL，加入3化水定容至1,000mL。定量分裝，2℃~8℃保存。2.5mL，攪拌均勻加純化水定容至1,000mL。定量分裝，2℃~8℃保存。純化水攪拌溶解，再加純化水定容至1,000mL，經(jīng)0.22μm過濾，置2℃~8℃保存。過濾，置2℃~8℃保存。稱取10mg的NHS，溶于1mLMES溶液中，臨用配制10min內使用。稱取10mg的EDC溶于1mLMES溶液中，臨用配制10min內使用。），攪拌均勻，PBS定容至1,000mL，經(jīng)0.22μm過濾，置2℃~8℃保存。9PBS定容至1,000mL。掃描配套的試劑盒、對照品、激發(fā)液A和激發(fā)液B的二維碼，將批