基因工程基本技術(shù)

基因工程的基本技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)第一節(jié)凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脫水—L—半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖

原理

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶瓊脂糖凝膠電泳影響電泳遷移速率的四大因素：1.電泳樣品的物理性質(zhì)影響泳動的首要因素是電泳樣品的物理性質(zhì)：包括電荷多少、分子大小、顆粒形狀和空間結(jié)構(gòu)。一般來說顆粒帶電荷的密度愈大，泳動速率愈快；顆粒物理形狀愈大，與支持物的摩擦力越大，泳動速率越小。即泳動率與顆粒的分子大小、介質(zhì)粘度成反比；與顆粒所帶電荷成正比。

1）電荷效應(yīng)DNA分子在凝膠介質(zhì)中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖一磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。

2)分子篩效應(yīng)具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。質(zhì)粒DNA樣品用單一切點(diǎn)的酶切后與已知相對分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對照，觀察其遷移距離，就可獲知該樣品的相對分子質(zhì)量大小。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以鑒別相對分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。

表瓊脂糖濃度與DNA分離范圍

3）構(gòu)型

在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋(SC)的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(0C)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀(L)分子。這3種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環(huán)狀分子。當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA時，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。

不同構(gòu)像質(zhì)粒2.支持物介質(zhì)DNA的凝膠電泳常使用兩種支持材料：瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。通過這兩種介質(zhì)的濃度變化調(diào)整所形成凝膠的分子篩網(wǎng)孔大小，分離不同分子量的核酸片斷。瓊脂糖的孔徑大，可以分離長度為100bp至60kb的核酸片斷；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（5-50bp）的核酸。3.電場強(qiáng)度電泳場兩極間單位支持物長度的電壓降即為電場強(qiáng)度或電壓梯度。電場強(qiáng)度愈大，帶電顆粒的泳動率愈快，但凝膠的有效分離范圍隨電壓的增大而減小。在低電壓時，線性DNA分子的泳動率與電壓成正比。一般凝膠電泳的電場強(qiáng)度不超過5V/cm。4.緩沖液離子強(qiáng)度緩沖液是電泳場中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。常用TAE、TBE、TPE三種緩沖體系。緩沖液的pH值直接影響DNA解離程度和電荷密度，緩沖液pH值與核酸樣品的等電點(diǎn)相距越遠(yuǎn)，樣品所攜帶電荷量越多，泳動速度越快。核酸電泳緩沖液，常采用偏堿性或中性條件，使核酸分子帶負(fù)電荷，向正極泳動。緩沖液的離子強(qiáng)度與樣品泳動速度呈反比，電泳的最適離子強(qiáng)度一般在0.02-0.2之間。瓊脂糖凝膠電泳的操作過程步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。(4)用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約30min-60min。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。實(shí)驗(yàn)步驟紫外線光源靈敏度:302nm>254nm>366nm結(jié)果與分析

圖2

PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖

(1、2、3、4為PCR產(chǎn)物，M為DL2000Marker)瓊脂糖凝膠電泳裝置實(shí)驗(yàn)步驟制膠90℃以上熔化，凝膠溫度35-43℃EB1231、孔深2、預(yù)留尺寸3、梳子寬度1+2=膠的厚度3-+加緩沖液拔梳子最好在電泳槽中-+點(diǎn)樣-+電泳紫外﹢﹣脈沖電場（PFGE）解決大分子DNA電泳問題第二節(jié)核酸分子雜交基本原理具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則退火形成雙鏈的過程。雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。變性復(fù)性

DNA-DNA雜交雙鏈分子Blotting定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程

Legend:SouthernBlotPartI:GelelectrophoresisfollowedbytransfertoamembraneDNACleavedwitharestrictionenzymeSmearofrestrictionfragmentsSouthernBlotPartII:HgybridizationofDNAonmembranetospecificprobeDNAstainedwithethidiumbromideautoradiographofhybridizedmembraneSouthernBlotNorthernBlotprobedwithb-globinUndifferentiatedcells+differentiationfactorNote:MakenorthernjustlikeaSouthern,exceptrunoutRNAsamplesratherthanDNAMeasuresthesteady-statelevelofmRNAtranscriptfromagivengeneSmearofRNAtranscriptsMakingaprobe一個理想的標(biāo)記物：1）標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;2）特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；3）操作簡單、節(jié)時；4）安全、無環(huán)境污染。1、標(biāo)記的種類同位素：

32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針非同位素：生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物

兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時間較長，無同位素污染。探針的標(biāo)記方法缺口平移法隨機(jī)引物標(biāo)記法末端標(biāo)記法生物素光照標(biāo)記法缺口平移法的原理

將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相結(jié)合。首先用DNAaseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。

這兩種活性同時作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。

隨機(jī)引物標(biāo)記法原理

用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對原則不斷在其3`-OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。末端標(biāo)記法原理（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個單標(biāo)記的ddUTP。生物素光照標(biāo)記法光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)加成反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)

WesternBlot基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。

細(xì)胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0有機(jī)溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的制備蛋白樣品的定量Bradford法

考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍(lán)工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml,3.5mg/ml,3.0mg/ml,2.5mg/ml,2.0mg/ml,1.5mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml。）管號012345678ddH2O807070707070707070蛋白標(biāo)準(zhǔn)液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強(qiáng)負(fù)價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素。丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺

SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212轉(zhuǎn)膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：480μg/cm2

；硝酸纖維素膜：80μg/cm2

）目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱需要更大的機(jī)械強(qiáng)度轉(zhuǎn)膜半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。

轉(zhuǎn)膜后檢測麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。封閉脫脂奶粉（5％）BSA（牛血清白蛋白）WesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)WesternBlot常見問題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適轉(zhuǎn)膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度UsingantibodiestodetectacloneSouthern,Northern,andWesternanalyses

細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)●

受體細(xì)胞(receptorcell)

又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(hostcell)等，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞;從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞。

●

感受態(tài)(competence)

細(xì)胞處于能夠吸收DNA的狀態(tài)，稱為感受態(tài)?！?/p>

感受態(tài)細(xì)胞(competencecell)

處于能夠吸收DNA狀態(tài)的細(xì)胞?！?/p>

細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程?！褶D(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞?！褶D(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過程?！?/p>

轉(zhuǎn)染(transfection):指病毒及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程?！?/p>

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指噬菌體及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。利用物理方法導(dǎo)入、轉(zhuǎn)化

1.質(zhì)粒的Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化(E.coli)2.質(zhì)粒的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

3.質(zhì)粒的高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化

4.顯微注射法轉(zhuǎn)化利用生物方法導(dǎo)入、轉(zhuǎn)染1.細(xì)胞噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染2.動物病毒DNA的轉(zhuǎn)染3.植物病毒DNA的轉(zhuǎn)染利用生物方法導(dǎo)入、轉(zhuǎn)染1.細(xì)胞噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染2.動物病毒DNA的轉(zhuǎn)染3.植物病毒DNA的轉(zhuǎn)染（一）氯化鈣法●

1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國斯坦福大學(xué)S.Cohen報道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒DNA。●

原理是：細(xì)菌處于0℃和低滲氯化鈣溶液中，菌細(xì)胞壁和膜通透性增加,菌體膨脹成球形，此時轉(zhuǎn)化混合物中DNA形成抗DNase羥基-磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)短暫熱休克(42℃)后，細(xì)胞膜形成許多間隙，DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。●

如果感受態(tài)細(xì)胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒DNA可得5×107～1×109個轉(zhuǎn)化子。

獲得合格的感受態(tài)細(xì)胞，要注意以下幾點(diǎn)：

1、用作受體菌的細(xì)胞在培養(yǎng)時要掌握好細(xì)胞密度，一般在A600為0.4左右為好。

2、制備受體細(xì)胞的整個過程在0～4℃進(jìn)行,盡量避免污染。如果用抗生素篩選轉(zhuǎn)化子，作為對照受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長。

3、為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合氯化鈣溶液，如FSB溶液。

（二）電穿孔法電穿孔法(electroporation):是指在一個較大的電脈沖短暫破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層，從而允許DNA等分子通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，而后細(xì)胞膜快速復(fù)原，保持細(xì)胞的完整。這種方法稱為電穿孔法。每μgDNA可以得到109～1010轉(zhuǎn)化子。當(dāng)電場強(qiáng)度和脈沖時間的組合方式導(dǎo)致50%～70%細(xì)菌死亡，轉(zhuǎn)化水平達(dá)到最高。TransformingE.coliwithrecombinantDNAGrowthofBacteriaGeneTransferviabiolistics(“genegun”)ParticlebombardmentBiolisticGunUbiquitinpromoterwhichismonocotspecificcontrollingabacterialreportergene,gusA,intransgenicrice.ParticlebombardmentBiolisticGunBiolisticbombardment(genegun)Transformationof AgrobacteriumClonedGeneinVectorDNAMoleculeProtoplasttransformationfollowedbycellwallregenerationAgrobacterium-mediatedtransformationofplantcellMigrationandintegrationofgeneintonucleusPlantcellsgrownintissuecultureRegenerationofgeneticallymodifiedplantfromtissuecultureGenetictransformationtechnologygermlinetransformationrelieson“totipotency”Plants-morecellshavetotipotency,buttheyalsohaveacellwallAgrobacteriumprotoplast-mediatedmicroprojectilebombardmentAnimals-gettingthegenesiniseasier,buttotipotencyisaproblemviralvectorsmicro-injectionMicroinjectiontechniqueMicroinjectiontechnology

microinjectionintothenucleusofafertilizedzygotecellsneedtobeimmobilisedcellwallsaredetrimentaltotheprocess(protoplastspreferred)damagetothecellmustbeavoidedamethodologyforregenerationofawholeorganismisrequiredplants-protoplastculture(invitro)animals-embryoimplantationprocedure(invivo)Problemscelldamage,lowsuccessratelabourintensiveexpensiveequipmentexpensivewholeanimalfacilitiesPCR技術(shù)及其應(yīng)用

目錄PCR的概念PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴(kuò)增（一）PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……（一）PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費(fèi)力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎KaryB.Mullis（1944－）（一）PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長（一）PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物（一）PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……PCR技術(shù)誕生所依賴的社會需求和研究需要基因組DNA獲取特定DNA片段擴(kuò)增特定DNA片段限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組DNA文庫DNA文庫20kBfragments插入噬菌體載體細(xì)菌擴(kuò)增裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素標(biāo)記轉(zhuǎn)印DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶1977年引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年94℃變性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)72℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理

無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類引物復(fù)習(xí)5’3’加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火2PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記3）操作簡便易行PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴(kuò)增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)增,還要用同位索探針進(jìn)行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時間。目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子4）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補(bǔ),延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。

總體積50-100lBuffer

緩沖液

dNTP原料

Primer引物

DNA分子模板

Taq酶DNA聚合酶

1反應(yīng)體系PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3PCR反應(yīng)條件（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever1）不對稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針

基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

PCR的類型

高濃度引物低濃度引物2)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。在一個反應(yīng)體系中使用一對以上引物的PCR稱為多重PCR。其結(jié)果是產(chǎn)生多個PCR產(chǎn)物，用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物12341234DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強(qiáng)度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式多重PCR檢測DMD基因缺失4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時檢測多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物5）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段兩測的序列

對于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？（固定化PCR）cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列

原位PCR的作用

既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。

ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達(dá)8）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增

RT－PCR:是以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板所進(jìn)行的PCR反應(yīng),用于測定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫?；騧RNA蛋白質(zhì)多肽鏈9)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。熒光標(biāo)記熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料

SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測不到5′端熒光分子發(fā)出的熒光