吸光光度法專題知識講座

第七章吸光光度法

Spectrophotometry思索題

1光度分析法誤差起源?2怎樣設(shè)計光度分析法？3光度分析法儀器特點？吸光光度法專題知識講座第1頁7.1概述1吸光光度法特點2光吸收基本定律3比色法和吸光光度法及其儀器吸光光度法專題知識講座第2頁7.1概述1

吸光光度法特點（1）定義：吸光光度法是基于物質(zhì)對光選擇性吸收而建立起來分析方法，包含比色法、可見及紫外吸光光度法及紅外光譜法等。我們重點討論可見光區(qū)吸光光度法。吸光光度法專題知識講座第3頁7.1概述（2）光基本性質(zhì)

吸光光度法專題知識講座第4頁7.1概述（3）吸收光譜產(chǎn)生原理*吸收光譜分為：原子吸收光譜和分子吸收光譜。是因物質(zhì)對不一樣波長光含有選擇性吸收作用而產(chǎn)生。*原子吸收光譜

Atomicabsorptionspectrum由原子外層電子選擇性地吸收一些波長電磁波而引發(fā)，為線狀光譜。線狀光譜-Linespectrum吸光光度法專題知識講座第5頁7.1概述*分子吸收光譜-帶狀光譜

molecularabsorptionspectrum

→由電子能級躍遷而產(chǎn)生吸收光譜[能量差在1~20(eV)]，是紫外及可見分光光度法。

UV/VisSpectrophotometry→由分子振動能級(能量差約0.05~leV)和轉(zhuǎn)動能級(能量差小于0.05eV)躍遷而產(chǎn)生吸收光譜，為紅外吸收光譜。用于分子結(jié)構(gòu)研究。

InfraredSpectrophotometry→帶狀光譜Bandspectrum吸光光度法專題知識講座第6頁7.1概述吸光光度法專題知識講座第7頁7.1概述*單色光（monochromaticlight）：具同一波長光。*復合光（multiplexlight）：由不一樣波長組成光。*紫外光（ultravioletlight）：波長200~400nm。*可見光（visiblelight）：人眼能感覺到光，波長在400~750nm。它是由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各種色光按一定百分比混合而成*波段（waveband）：各種色光波長范圍不一樣。*互補色光（complementarycolorlight）：按一定百分比混合，得到白光（whitelight）。*物質(zhì)顏色是因物質(zhì)對不一樣波長光含有選擇性吸收作用而產(chǎn)生。吸光光度法專題知識講座第8頁7.1概述吸光光度法專題知識講座第9頁7.1概述*吸收光譜曲線或光吸收曲線（absorptioncurve）：以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖。*最大吸收波長（maximumabsorptionwavelengh）：光吸收程度最大處波長，用λmax表示*吸光度（absorbance）

在可見光，KMnO4溶液對波長525nm附近綠色光吸收最強，而對紫色和紅色吸收很弱。λmax=525nm。濃度不一樣時，光吸收曲線形狀相同，λmax不變，吸光度不一樣。吸光光度法專題知識講座第10頁7.1概述（4）目視比色法(colorimetry)和吸光光度法特點

a靈敏度高。慣用于測定試樣中質(zhì)量分數(shù)為1%~10-5微量組分，甚至可測定低至質(zhì)量分數(shù)為10-6~10-8痕量組分。b準確度較高。目視比色法相對誤差為5%~10%，吸光光度法為2%~5%。c應用廣泛。幾乎全部無機離子和許多有機化合物都能夠直接或間接地用目視比色法或吸光光度法進行測定。d儀器簡單、操作簡便、快速。吸光光度法專題知識講座第11頁7.1概述2光吸收基本定律(1)朗伯-比爾定律（Lambert-Beerlaw）

當一束平行單色光經(jīng)過任何均勻、非散射固體、液體或氣體介質(zhì)時，一部分被吸收，一部分透過介質(zhì)，一部分被器皿表面反射。如圖6-3所表示，設(shè)人射光強度為I'0，吸收光強度為Ia，透過光強度為It，反射光強度為Ir。吸光光度法專題知識講座第12頁7.1概述

在吸光光度分析法中，試液和空白溶液分別置于一樣質(zhì)料及厚度吸收池中，然后讓強度為I‘0單色光分別經(jīng)過這兩個吸收池，再測量其透過光強度。此時反射光強度基本上是不變，且其影響能夠相互抵消。吸光光度法專題知識講座第13頁7.1概述透射比或透光度（Transmittance）

透過光強度It與人射光強度Io之比稱為透射比或透光度，用T表示溶液透射比愈大，表示它對光吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它對光吸收愈大。吸光光度法專題知識講座第14頁7.1概述朗伯(LambertJH)和比爾(BeerA)分別于1760和1852年研究了光吸收與溶液層厚度及溶液濃度定量關(guān)系，二者結(jié)合稱為朗伯-比爾定律，也稱為光吸收定律。

當一束強度為I0平行單色光垂直照射到長度為b液層、濃度為c溶液時，因為溶液中吸光質(zhì)點(分子或離子)吸收，經(jīng)過溶液后光強度減弱為I：吸光光度法專題知識講座第15頁7.1概述*朗伯-比爾定律表明：當一束單色光經(jīng)過含有吸光物質(zhì)溶液后，溶液吸光度與吸光物質(zhì)濃度及吸收層厚度成正比。這是進行定量分析理論基礎(chǔ)。百分比常數(shù)K與吸光物質(zhì)性質(zhì)、入射光波長及溫度等原因相關(guān)。*含有各種吸光物質(zhì)溶液，因為各吸光物質(zhì)對某一波長單色光都有吸收作用，若各吸光物質(zhì)吸光質(zhì)點之間相互不發(fā)生化學反應，當某一波長單色光經(jīng)過這么一個含有各種吸光物質(zhì)溶液時，溶液總吸光度應等于各吸光物質(zhì)吸光度之和。這一規(guī)律稱吸光度加和性。吸光光度法專題知識講座第16頁7.1概述（2）摩爾吸收系數(shù)和桑德爾靈敏度*摩爾吸收系數(shù)molarabsorptivity當濃度c用mol·L-1，液層厚度b用cm為單位表示，則K用另一符號ε來表示。ε稱為摩爾吸收系數(shù)，單位為L·mol-l·m-1，它表示物質(zhì)量濃度為lmol·L-1，液層厚度為lcm時溶液吸光度。吸光光度法專題知識講座第17頁7.1概述*桑德爾(Sandell)靈敏度(靈敏度指數(shù))S來表示。S是指當儀器檢測極限A=0.001時，單位截面積光程內(nèi)所能檢測出來吸光物質(zhì)最低含量，其單位為μg·cm-2，S與ε及吸光物質(zhì)摩爾質(zhì)量M關(guān)系為：吸光光度法專題知識講座第18頁7.1概述3比色法和吸光光度法及其儀器（1）目視比色法colorimetry

用眼睛觀察、比較溶液顏色深度以確定物質(zhì)含量方法。優(yōu)點是儀器簡單，操作簡便，適宜于大批試樣分析。靈敏度高，因為是在復合光-白光下進行測定，故一些顯色反應不符合朗伯-比爾定律時，仍可用該法進行測定。主要缺點是準確度不高，標準系列不能久存，需要在測定時暫時配制。吸光光度法專題知識講座第19頁7.1概述（2）吸光光度法Spectrophotometry

借助分光光度計來測量一系列標準溶液吸光度，繪制標準曲線，依據(jù)被測試液吸光度，從標準曲線上求得被測物質(zhì)濃度或含量。Standardcurve-calibratedcurve-workingcurve吸光光度法與目視比色法在原理上不一樣。吸光光度法是比較有色溶液對某一波長光吸收情況，目視比色法則是比較透過光強度。比如，測KMnO4含量，吸光光度法測量是KMnO4溶液對黃綠色光吸收情況，目視比色法則是比較KMnO4溶液透過紅紫色光強度。吸光光度法專題知識講座第20頁7.1概述*吸光光度法特點：入射光是純度較高單色光，故便偏離朗伯-比爾定律情況大為降低，標準曲線直線部分范圍更大，分析結(jié)果準確度較高。因可任意選取某種波長單色光，故利用吸光度加和性，同時測定溶液中兩種或兩種以上組分。因為入射光波長范圍擴大了，許多無色物質(zhì)，只要它們在紫外或紅外光區(qū)域內(nèi)有吸收峰，都能夠測定。吸光光度法專題知識講座第21頁7.1概述(3)分光光度計及其基本部件

分光光度計按工作波長范圍分類，紫外、可見分光光度計應用于無機物和有機物含量測定，紅外分光光度計主要用于結(jié)構(gòu)分析。分光光度計又可分為單光束和雙光束兩類。722型分光光度計是數(shù)字顯示單光束、可見分光光度計（recordingspectrophotometer）。

舊光電比色計（photoelectriccolorimeter）

分光光度計基本部件:光源、單色器、比色皿、檢測器和顯示裝置。吸光光度法專題知識講座第22頁7.1概述吸光光度法專題知識講座第23頁7.1概述*光源（lightsource）

用6~12V鎢絲燈作可見光區(qū)光源，發(fā)出連續(xù)光譜在360~800nm范圍內(nèi)。光源應該穩(wěn)定，即要求電源電壓保持穩(wěn)定。為此，通常在儀器內(nèi)同時配有電源穩(wěn)壓器。

氫燈氘燈鎢燈汞燈

hydrogendeuteriumtungstenmercurylamplamplamplamp吸光光度法專題知識講座第24頁7.1概述*單色器monochromator

單色器作用是將光源發(fā)出連續(xù)光譜分解為單色光裝置。分為棱鏡和光柵。棱鏡（prism）：依據(jù)光折射原理而將復合光色散為不一樣波長單色光，然后再讓所需波長光經(jīng)過一個很窄狹縫（slit）照射到吸收池上。由玻璃或石英制成。玻璃棱鏡用于可見光范圍，石英棱鏡則在紫外和可見光范圍均可使用。吸光光度法專題知識講座第25頁7.1概述

光柵（grating）是依據(jù)光衍射和干涉原理將復合光色散為不一樣波長單色光，然后再讓所需波長光經(jīng)過狹縫照射到吸收池上。它分辨率比棱鏡大，可用波長范圍也較寬。濾光片（filter）吸光光度法專題知識講座第26頁7.1概述*比色皿(coloritrough)也稱吸收池。用于盛放試液容器。它是由無色透明、耐腐蝕、化學性質(zhì)相同、厚度相等玻璃制成，按其厚度分為0.5cm，lcm，2cm，3cm和5cm。在可見光區(qū)測量吸光度時使用玻璃吸收池，紫外區(qū)則使用石英吸收池。使用比色皿時應注意保持清潔、透明，防止磨損透光面。吸光光度法專題知識講座第27頁7.1概述*檢測器detector

接收從比色皿發(fā)出透射光并轉(zhuǎn)換成電信號進行測量。分為光電管和光電倍增管。光電管（phototube）：一個真空或充有少許惰性氣體二極管。陰極是金屬做成半圓筒，內(nèi)側(cè)涂有光敏物質(zhì)，陽極為一金屬絲。光電管依其對光敏感波長范圍不一樣分為紅敏和紫敏兩種。紅敏光電管是在陰極表面涂銀和氧化銫，適用波長范圍為625~1000nm;紫敏光電管是陰極表面涂銻和銫，適用波長范圍為200~625nm。吸光光度法專題知識講座第28頁7.1概述

光電倍增管（photomultiplier）由光電管改進而成，管中有若千個稱為倍增極附加電極?？墒构饧ぐl(fā)電流得以放大，一個光子約產(chǎn)生106~107個電子。它靈敏度比光電管高200多倍。適用波長范圍為160~700nm。光電倍增管在當代分光光度計中被廣泛采取。

光電池photocell吸光光度法專題知識講座第29頁7.1概述*顯示裝置

作用是把放大信號以吸光度A或透射比T光度分析法設(shè)計方式顯示或統(tǒng)計下來。分光光度計慣用顯示裝置是檢流計、微安表、數(shù)字顯示統(tǒng)計儀。吸光光度法專題知識講座第30頁

7.2光度分析法設(shè)計

1顯色反應2顯色條件選擇3測量波長和吸光度范圍選擇4參比溶液選擇5標準曲線制作吸光光度法專題知識講座第31頁7.2光度分析法設(shè)計1顯色反應（colorreaction）待測物質(zhì)本身有較深顏色，直接測定；待測物質(zhì)是無色或很淺顏色，需要選適當試劑與被測離子反應生成有色化合物再進行測定，此反應稱為顯色反應，所用試劑稱為顯色劑（colorreagent）。

按顯色反應類型來分，主要有氧化還原反應和絡(luò)合反應兩大類，而絡(luò)合反應是最主要。吸光光度法專題知識講座第32頁7.2光度分析法設(shè)計（1）顯色反應選擇A選擇性好，干擾少，或干擾輕易消除;靈敏度高，有色物質(zhì)ε應大于104。B有色化合物組成恒定，符合一定化學式。C有色化合物化學性質(zhì)穩(wěn)定，最少確保在測量過程中溶液吸光度基本恒定。這就要求有色化合物不輕易受外界環(huán)境條件影響。D有色化合物與顯色劑之間顏色差異要大，即顯色劑對光吸收與絡(luò)合物吸收有顯著區(qū)分，要求二者吸收峰波長之差Δλ(稱為對比度)大于60nm。吸光光度法專題知識講座第33頁7.2光度分析法設(shè)計（2）顯色劑無機顯色劑不多，因為生成絡(luò)合物不穩(wěn)定，靈敏度和選擇性也不高。如用KSCN顯色測鐵、鉬、鎢和鈮；用鉬酸銨顯色測硅、磷和釩;用H2O2顯色測鈦等。

有機顯色劑分子中含有生色團（chromophoricgroup）和助色團（auxochromegroup）。生色團是一些含不飽和鍵基團，如偶氮基、對醌基和羰基等。這些基團中π電子被激發(fā)時需能量較小，可吸收波長200nm以上可見光而顯色。助色團是含孤對電子基團，如氨基、羥基和鹵代基等。這些基團與生色團上不飽和鍵作用，使顏色加深。吸光光度法專題知識講座第34頁7.2光度分析法設(shè)計有機顯色劑A磺基水楊酸OO型螯合劑，可與很多高價金屬離子生成穩(wěn)定螯合物，主要用于測Fe3+。B丁二酮肟NN型螯合顯色劑，用于測定Ni2+。C1，10-鄰二氮菲NN型螯合顯色劑，測微量Fe2+。D二苯硫腙含S顯色劑，萃取光度測定Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+等。E偶氮胂Ⅲ(鈾試劑Ⅲ)偶氮類螯合劑，強酸性溶液中測Th(Ⅳ),Zr(Ⅳ)，U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中測稀土金屬離子。F鉻天青S三苯甲烷類顯色劑，測定Al3+。G結(jié)晶紫三苯甲烷類堿性染料，測定Tl3+。吸光光度法專題知識講座第35頁7.2光度分析法設(shè)計（3）多元絡(luò)合物

多元絡(luò)合物是由三種或三種以上組分所形成絡(luò)合物。當前應用較多是由一個金屬離子與兩種配位體所組成三元絡(luò)合物。三元絡(luò)合物在吸光光度分析中應用較普遍。主要三元絡(luò)合物類型。*三元混配絡(luò)合物金屬離子與一個絡(luò)合劑形成未飽和絡(luò)合物，然后與另一個絡(luò)合劑結(jié)合，形成三元混合配位絡(luò)合物，簡稱三元混配絡(luò)合物。比如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮間苯二酚(PAR)形成1:1:1有色絡(luò)合物，可用于釩測定，其靈敏度高，選擇性好。吸光光度法專題知識講座第36頁7.2光度分析法設(shè)計*

離子締合物金屬離子先與絡(luò)合劑生成絡(luò)陰離子或絡(luò)陽離子，再與帶反電荷離子生成離子締合物。主要用于萃取光度法。如，Ag+與1，10-鄰二氮菲形成陽離子，再與溴鄰苯三酚紅陰離子形成深藍色離子締合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽劑，可測定微量Ag+。作為離子締合物陽離子，有堿性染料、1，10-鄰二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、銻)等;作為陰離子，有X-，SCN-，ClO4-，無機雜多酸和一些酸性染料等。吸光光度法專題知識講座第37頁7.2光度分析法設(shè)計

*金屬離子-絡(luò)合劑-表面活性劑體系

金屬離子與顯色劑反應時，加入一些表面活性劑，能夠形成膠束化合物，它們吸收峰向長波方向移動(紅移)，而測定靈敏度顯著提升。當前，慣用于這類反應表面活性劑有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基芐胺、氯化十六烷基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨、溴化羥基十二烷基三甲基銨、OP乳化劑。比如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反應，生成三元絡(luò)合物，在pH8~9時呈藍紫色，用于痕量稀土元素總量測定。吸光光度法專題知識講座第38頁7.2光度分析法設(shè)計*雜多酸

溶液在酸性條件下，過量鉬酸鹽與磷酸鹽、硅酸鹽、砷酸鹽等含氧陰離子作用生成雜多酸，作為吸光光度法測定對應磷、硅、砷等元素基礎(chǔ)。雜多酸法需要還原反應酸度范圍較窄，必須嚴格控制反應條件。很多還原劑都可應用于雜多酸法中。氯化亞錫及一些有機還原劑，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亞硫酸鹽和氫醌慣用于磷測定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷鉬酸鹽和磷鉬酸鹽還原劑?？箟难嵋彩呛芎眠€原劑。吸光光度法專題知識講座第39頁7.2光度分析法設(shè)計2顯色條件選擇

試驗條件包含:溶液酸度，顯色劑用量，試劑加入次序，顯色時間，顯色溫度，有機絡(luò)合物穩(wěn)定性及共存離子干擾等。（1）溶液酸度M+HR===MR+H+*影響顯色劑平衡濃度和顏色*影響被測金屬離子存在狀態(tài)*影響絡(luò)合物組成

*pH與吸光度關(guān)系曲線確定pH范圍。吸光光度法專題知識講座第40頁7.2光度分析法設(shè)計（2）顯色劑用量M(被測組分)+R(顯色劑)==MR(有色絡(luò)合物)為使顯色反應進行完全，需加入過量顯色劑。但顯色劑不是越多越好。有些顯色反應，顯色劑加人太多，反而會引發(fā)副反應，對測定不利。在實際工作中依據(jù)試驗結(jié)果來確定顯色劑用量。

吸光光度法專題知識講座第41頁7.2光度分析法設(shè)計（3）顯色反應時間

有些顯色反應瞬間完成，溶液顏色很快到達穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長時間內(nèi)保持不變;有些顯色反應雖能快速完成，但有色絡(luò)合物顏色很快開始褪色;有些顯色反應進行遲緩，溶液顏色需經(jīng)一段時間后才穩(wěn)定。制作吸光度-時間曲線確定適宜時間。（4）顯色反應溫度：顯色反應大多在室溫下進行。不過，有些顯色反應必需加熱至一定溫度完成。（5）溶劑：有機溶劑降低有色化合物解離度，提升顯色反應靈敏度。如在Fe(SCN)3溶液中加入丙酮顏色加深。還可能提升顯色反應速率，影響有色絡(luò)合物溶解度和組成等。吸光光度法專題知識講座第42頁7.2光度分析法設(shè)計（6）干擾及其消除方法

試樣中存在干擾物質(zhì)會影響被測組分測定。比如干擾物質(zhì)本身有顏色或與顯色劑反應，在測量條件下也有吸收，造成正干擾。干擾物質(zhì)與被測組分反應或與顯色劑反應，便顯色反應不完全，也會造成干擾。干擾物質(zhì)在測量條件下從溶液中析出，便溶液變混濁，無法準確測定溶液吸光度。為消除以上原因引發(fā)干擾，可采取以下幾個方法。吸光光度法專題知識講座第43頁7.2光度分析法設(shè)計a.控制溶液酸度b.加入掩蔽劑選取條件是掩蔽劑不與待測離子作用，掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成絡(luò)合物顏色應不干擾待測離子測定。c.利用氧化還原反應，改變干擾離子價態(tài)d.利用校正系數(shù)e.用參比溶液消除顯色劑和一些共存有色離子干擾。f.選擇適當波長g.當溶液中存在有消耗顯色劑干擾離子時，可經(jīng)過增加顯色劑用量來消除干擾。h.分離以上方法均不奏效時，采取預先分離方法。吸光光度法專題知識講座第44頁7.2光度分析法設(shè)計3測量波長和吸光度范圍選擇（1）測量波長選擇為了使測定結(jié)果有較高靈敏度，應選擇被測物質(zhì)最大吸收波長光作為入射光，這稱為“最大吸收標準”（maximumabsorption）。選取這種波長光進行分析，不但靈敏度高，且能降低或消除由非單色光引發(fā)對朗伯-比爾定律偏離。不過，在最大吸收波優(yōu)點有其它吸光物質(zhì)干擾測定時，則應依據(jù)入射光波長。吸光光度法專題知識講座第45頁7.2光度分析法設(shè)計例丁二酮肟光度法測鋼中鎳，絡(luò)合物丁二酮肟鎳最大吸收波長為470nm，但試樣中鐵用酒石酸鈉掩蔽后，在470nm處也有一定吸收，干擾鎳測定。為防止鐵干擾，能夠選擇波長520nm進行測定，即使測鎳靈敏度有所降低，但酒石酸鐵不干擾鎳測定。吸光光度法專題知識講座第46頁7.2光度分析法設(shè)計（2）吸光度范圍選擇從儀器測量誤差角度來看，為使測量結(jié)果得到較高準確度，普通應控制標準溶液和被測試液吸光度在0.2~0.8范圍內(nèi)。可經(jīng)過控制溶液濃度或選擇不一樣厚度吸收池來到達目標。吸光光度法專題知識講座第47頁7.2光度分析法設(shè)計

4參比溶液選擇利用參比溶液來調(diào)整儀器零點，可消除由吸收池壁及溶劑對入射光反射和吸收帶來誤差，扣除干擾影響。參比溶液選擇：a試液及顯色劑均無色，蒸餾水作參比溶液。b顯色劑為無色，被測試液中存在其它有色離子，用不加顯色劑被測試液作參比溶液。c顯色劑有顏色，可選擇不加試樣溶液試劑空白作參比溶液。吸光光度法專題知識講座第48頁7.2光度分析法設(shè)計d顯色劑和試液都有顏色，可將一份試液加入適當掩蔽劑，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其它試劑均按試液測定方法加入，以此作為參比溶液，這么就能夠消除顯色劑和一些共存組分干擾。e改變加入試劑次序，使被測組分不發(fā)生顯色反應，能夠此溶液作為參比溶液消除干擾。吸光光度法專題知識講座第49頁7.2光度分析法設(shè)計5標準曲線制作

依據(jù)光吸收定律:吸光度與吸光物質(zhì)含量成正比，這是光度法進行定量基礎(chǔ)，標準曲線就是依據(jù)這一原理制作。詳細方法為:在選擇試驗條件下分別測量一系列不一樣含量標準溶液吸光度，以標準溶液中待測組分含量為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得到一條經(jīng)過原點直線，稱為標準曲線，此時測量待測溶液吸光度，在標準曲線上就能夠查到與之相對應被測物質(zhì)含量。吸光光度法專題知識講座第50頁7.2光度分析法設(shè)計*有時標準曲線不經(jīng)過原點?？赡苁且驗閰⒈热芤哼x擇不妥，吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清潔等原因所引發(fā)。若有色絡(luò)合物解離度較大，尤其是當溶液中還有其它絡(luò)合劑時，常便被測物質(zhì)在低濃度時顯色不完全。找出原因，加以防止。吸光光度法專題知識講座第51頁7.3光度分析法誤差1對朗伯-比爾定律偏離2吸光度測量誤差吸光光度法專題知識講座第52頁7.3光度分析法誤差1對朗伯-比爾定律偏離

在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標準曲線不呈直線情況，尤其是當吸光物質(zhì)濃度較高時，顯著地看到經(jīng)過原點向濃度軸彎曲現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引發(fā)較大誤差。偏離朗伯－比爾定律原因主要是儀器或溶液實際條件與朗伯-比爾定律所要求理想條件不一致。吸光光度法專題知識講座第53頁7.3光度分析法誤差（1）非單色光引發(fā)偏離*朗伯-比爾定律只適合用于單色光，但因為單色器色散能力限制和出口狹縫需要保持一定寬度，所以當前各種分光光度計得到入射光實際上都是含有某一波段復合光。因為物質(zhì)對不一樣波長光吸收程度不一樣，因而造成對朗伯－比爾定律偏離。

吸光光度法專題知識講座第54頁7.3光度分析法誤差*克服非單色光引發(fā)偏離辦法◎使用比很好單色器，從而取得純度較高“單色光”，使標準曲線有較寬線性范圍。◎人射光波長選擇在被測物質(zhì)最大吸收處，確保測定有較高靈敏度，此處吸收曲線較為平坦，在此最大吸收波長附近各波長光ε值大致相等，因為非單色光引發(fā)偏離要比在其它波優(yōu)點小得多?！驕y定時應選擇適當濃度范圍，使吸光度讀數(shù)在標準曲線線性范圍內(nèi)。吸光光度法專題知識講座第55頁7.3光度分析法誤差（2）介質(zhì)不均勻引發(fā)偏離朗伯－比爾定律要求吸光物質(zhì)溶液是均勻。假如被測溶液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或懸浮液時，入射光經(jīng)過溶液后，除一部分被試液吸收外，還有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比降低，因而實測吸光度增加，便標準曲線偏離直線向吸光度軸彎曲。故在光度法中應防止溶液產(chǎn)生膠體或混濁。吸光光度法專題知識講座第56頁7.3光度分析法誤差（3）因為溶液本身化學反應引發(fā)偏離溶液中吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學改變而改變其濃度，因而造成偏離朗伯—比爾定律。A解離大部分有機酸堿酸式、堿式對光有不一樣吸收性質(zhì)，溶液酸度不一樣，酸(堿)解離程度不一樣，造成酸式與堿式百分比改變，使溶液吸光度發(fā)生改變。B絡(luò)合顯色劑與金屬離子生成是多級絡(luò)合物，且各級絡(luò)合物對光吸收性質(zhì)不一樣，比如在Fe(Ⅲ)與SCN-絡(luò)合物中，F(xiàn)e(SCN)3顏色最深，F(xiàn)e(SCN)2+顏色最淺，故SCN-濃度越大，溶液顏色越深，即吸光度越大。吸光光度法專題知識講座第57頁7.3光度分析法誤差

c締合比如在酸性條件下，CrO42-會締合生成Cr2O72-，而它們對光吸收有很大不一樣。在分析測定中，要控制溶液條件，使被測組分以一個形式存在，以克服化學原因所引發(fā)對朗伯－比爾定律偏離。吸光光度法專題知識講座第58頁7.3光度分析法誤差2吸光度測量誤差在吸光光度分析中，儀器測量不準確也是誤差主要起源。任何光度計都有一定測量誤差。這些誤差可能起源于光源不穩(wěn)定，試驗條件偶然變動，讀數(shù)不準確等。

在光度計中，透射比標尺刻度均勻。吸光度標尺刻度不均勻。對于同一儀器，讀數(shù)波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數(shù)波動則不再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動所引發(fā)吸光度誤差也越大吸光光度法專題知識講座第59頁7.3光度分析法誤差

透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺中間而不落兩端。待測溶液透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能確保測量相對誤差較小。當A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量相對誤差最小。

吸光光度法專題知識講座第60頁本章作業(yè)p2384，5p23911，13吸光光度法專題知識講座第61頁7.3光度分析法誤差1對朗伯-比爾定律偏離2吸光度測量誤差吸光光度法專題知識講座第62頁7.3光度分析法誤差1對朗伯-比爾定律偏離

在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標準曲線不呈直線情況，尤其是當吸光物質(zhì)濃度較高時，顯著地看到經(jīng)過原點向濃度軸彎曲現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引發(fā)較大誤差。偏離朗伯－比爾定律原因主要是儀器或溶液實際條件與朗伯-比爾定律所要求理想條件不一致。吸光光度法專題知識講座第63頁7.3光度分析法誤差（1）非單色光引發(fā)偏離*朗伯-比爾定律只適合用于單色光，但因為單色器色散能力限制和出口狹縫需要保持一定寬度，所以當前各種分光光度計得到入射光實際上都是含有某一波段復合光。因為物質(zhì)對不一樣波長光吸收程度不一樣，因而造成對朗伯－比爾定律偏離。

吸光光度法專題知識講座第64頁7.3光度分析法誤差*克服非單色光引發(fā)偏離辦法◎使用比很好單色器，從而取得純度較高“單色光”，使標準曲線有較寬線性范圍。◎人射光波長選擇在被測物質(zhì)最大吸收處，確保測定有較高靈敏度，此處吸收曲線較為平坦，在此最大吸收波長附近各波長光ε值大致相等，因為非單色光引發(fā)偏離要比在其它波優(yōu)點小得多。◎測定時應選擇適當濃度范圍，使吸光度讀數(shù)在標準曲線線性范圍內(nèi)。吸光光度法專題知識講座第65頁7.3光度分析法誤差（2）介質(zhì)不均勻引發(fā)偏離朗伯－比爾定律要求吸光物質(zhì)溶液是均勻。假如被測溶液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或懸浮液時，入射光經(jīng)過溶液后，除一部分被試液吸收外，還有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比降低，因而實測吸光度增加，便標準曲線偏離直線向吸光度軸彎曲。故在光度法中應防止溶液產(chǎn)生膠體或混濁。吸光光度法專題知識講座第66頁7.3光度分析法誤差（3）因為溶液本身化學反應引發(fā)偏離溶液中吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學改變而改變其濃度，因而造成偏離朗伯—比爾定律。A解離大部分有機酸堿酸式、堿式對光有不一樣吸收性質(zhì)，溶液酸度不一樣，酸(堿)解離程度不一樣，造成酸式與堿式百分比改變，使溶液吸光度發(fā)生改變。B絡(luò)合顯色劑與金屬離子生成是多級絡(luò)合物，且各級絡(luò)合物對光吸收性質(zhì)不一樣，比如在Fe(Ⅲ)與SCN-絡(luò)合物中，F(xiàn)e(SCN)3顏色最深，F(xiàn)e(SCN)2+顏色最淺，故SCN-濃度越大，溶液顏色越深，即吸光度越大。吸光光度法專題知識講座第67頁7.3光度分析法誤差

c締合比如在酸性條件下，CrO42-會締合生成Cr2O72-，而它們對光吸收有很大不一樣。在分析測定中，要控制溶液條件，使被測組分以一個形式存在，以克服化學原因所引發(fā)對朗伯－比爾定律偏離。吸光光度法專題知識講座第68頁7.3光度分析法誤差2吸光度測量誤差在吸光光度分析中，儀器測量不準確也是誤差主要起源。任何光度計都有一定測量誤差。這些誤差可能起源于光源不穩(wěn)定，試驗條件偶然變動，讀數(shù)不準確等。

在光度計中，透射比標尺刻度均勻。吸光度標尺刻度不均勻。對于同一儀器，讀數(shù)波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數(shù)波動則不再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動所引發(fā)吸光度誤差也越大吸光光度法專題知識講座第69頁7.3光度分析法誤差

透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺中間而不落兩端。待測溶液透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能確保測量相對誤差較小。當A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量相對誤差最小。

吸光光度法專題知識講座第70頁7.4其它吸光光度法及吸光光度法應用1示差吸光光度法2雙波長吸光光度法3弱酸和弱堿解離常數(shù)測定4絡(luò)合物組成測定吸光光度法專題知識講座第71頁7.4其它吸光光度法及吸光光度法應用1示差吸光光度法（differential）（1）示差吸光光度法原理

吸光光度法普通僅適合用于微量組分測定，當待測定組分濃度過高或過低，會引發(fā)很大測量誤差，造成準確度降低。示差吸光光度法可克服這一缺點。當前，主要有高濃度示差吸光光度法、低濃度示差吸光光度法和使用兩個參比溶液精密示差吸光光度法。它們基本原理相同，且以高濃度示差吸光光度法應用最多，僅介紹高濃度示差吸光光度法。吸光光度法專題知識講座第72頁7.4其它吸光光度法及吸光光度法應用

吸光度差與這兩種溶液濃度差成正比。以把空白溶液作為參比稀溶液標準曲線作為ΔA和Δc標準曲線，依據(jù)測得ΔA求出對應Δc值，從cx=co+c可求出待測試液濃度，這就是示差吸光光度法定量基本原理。吸光光度法專題知識講座第73頁7.4其它吸光光度法及吸光光度法應用（2）示差吸光光度法誤差Δc(即cx－co)，測量誤差為x%，結(jié)果為cx±(cx-co