一株紅樹內(nèi)生真菌的培養(yǎng)、發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的研究

一株紅樹內(nèi)生真菌的培養(yǎng)、發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的研究【摘要】目的：將一株紅樹內(nèi)生真菌1512107進行發(fā)酵，對其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量進行研究并分析其代謝物的豐富度。方法：從紅樹植物海桑樹葉中分離純化得到16株真菌，選取其中編號為1512107的一株作為供試菌株，通過PDA平板活化菌株，再使用PYG液體培養(yǎng)基制備種子培養(yǎng)液以及使用大米固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，往靜置發(fā)酵30天后的菌餅中加入甲醇，浸泡4次，每次浸泡24h，得到甲醇提取液。將甲醇提取液進行過濾、濃縮，并用乙酸乙酯萃取，回收有機相，使產(chǎn)物自然揮干，得到浸膏。最后對得到的浸膏進行稱重及薄層色譜分析其代謝產(chǎn)物的豐富度。結(jié)果：經(jīng)發(fā)酵提取后得到代謝產(chǎn)物浸膏的量超出預期結(jié)果，通過對薄層色譜分析，結(jié)果顯示代謝產(chǎn)物豐富度較高，符合預期結(jié)果。結(jié)論：通過研究證實，本次實驗使用的方法適用于紅樹植物海桑樹葉內(nèi)生真菌的培養(yǎng)，為后續(xù)新型活性代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和分析奠定基礎?！娟P鍵詞】紅樹林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物；發(fā)酵FermentationandAnalysisofMetabolitesofAMangroveEndophyticFungus[Abstract]Purpose:Amangroveendophyticfungus1512107wasfermentedtostudytheyieldofitsmetabolitesandanalyzetheabundanceofitsmetabolites.Methods:SixteenfungalstrainswereisolatedandpurifiedfromtheleavesofthemangroveplantHaisang.Onestrain,numbered1512107,wasselectedastheteststrain.ThestrainwasactivatedusingaPDAplate,andthenseedculturemediumwaspreparedusingPYGliquidculturemedium.Ricesolidculturemediumwasusedtoexpandtheculture.Methanolwasaddedtothebacterialcakeafter30daysofstaticfermentation,soakedfourtimes,eachtimefor24hours,toobtainmethanolextract.Filterandconcentratethemethanolextract,andextractwithethylacetatetorecovertheorganicphase,allowingtheproducttoevaporatenaturallyandobtainanextract.Finally,theobtainedextractwasweighedandanalyzedfortheabundanceofitsmetabolitesbythinlayerchromatography.Results:Afterfermentationextraction,theamountofmetaboliteextractobtainedexceededtheexpectedresults.Throughthinlayerchromatographyanalysis,theresultsshowedahighabundanceofmetabolite,whichmettheexpectedresults.Conclusion：Throughresearch,ithasbeenconfirmedthatthemethodusedinthisexperimentissuitableforthecultivationofendophyticfungiintheleavesofthemangroveplantMorusalba,layingthefoundationforthediscoveryandanalysisofnewactivemetabolitesinthefuture.[Keywords]mangrove;Endophyticfungi;metabolites;ferment

目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言1.1海洋微生物及其研究現(xiàn)狀海洋覆蓋了近70%的地球表面，擁有巨大的生態(tài)、化學和生物多樣性[1]。海洋微生物來自（或分離自）海洋環(huán)境，其正常生長需要海水，并可在寡營養(yǎng)、低溫條件（或高壓、高溫、高鹽等極端環(huán)境）下長期存活并能持續(xù)繁殖子代[2]。海洋微生物獨特的生存環(huán)境造就了其獨一無二的生存、適應、新陳代謝機制，并且因此產(chǎn)生了眾多結(jié)構(gòu)獨特，擁有抗菌、抗病毒等活性的次級代謝產(chǎn)物。根據(jù)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署的全球生物多樣性評估，有178000種海洋物種屬于34個門，因此，海洋的生物多樣性占全球生物多樣性的50%，使海洋微生物有望成為新型生物活性化合物的可持續(xù)來源[3]?？梢院敛豢鋸埖卣f，海洋是一個天然的聚寶盆，里面有數(shù)不清的資源等待著科學家們?nèi)ヌ剿?。隨著對海洋的不斷探索，經(jīng)研究員確定的海洋天然產(chǎn)物數(shù)量呈直線趨勢不斷上升，現(xiàn)有超過28175個化學實體被確定。不僅如此，每年仍有數(shù)百種新化合物被發(fā)現(xiàn)。它們的范圍從氨基酸和核苷的衍生物擴大到大環(huán)內(nèi)酯類、卟啉、萜類化合物再擴大到脂肪族環(huán)狀過氧化物和甾醇[1]。在探索海洋微生物種類的同時，科學家們對其功能的探索也在同步推進。海洋微生物代謝的有機化合物分子主要可以分為抗菌、抗病毒、抗腫瘤、酶抑制、維生素和極端酶。其中海洋微生物具備抗腫瘤功能的活性成分，已經(jīng)被運用于醫(yī)學，獲得了良好的效果。海洋微生物活性物質(zhì)的抗生素運用也在最近幾年快速發(fā)展起來[4]。近年來研究最多的海洋細菌是芽孢桿菌屬,已從中分離出多種對臨床病原菌有抑制作用的活性物質(zhì)。傳統(tǒng)抗真菌劑的耐藥性與毒性問題的出現(xiàn)增加了無毒抗真菌劑開發(fā)的需求[5]。日本的Shigemori從海魚Apogonendekatanum中分離到一株真菌Penicilliumfellutanum，并從其發(fā)酵物中得到2種肽類物質(zhì)fellutanwnA和B。藥理試驗發(fā)現(xiàn)，它們在體外均對鼠白血病細胞P388有細胞毒性(ICs分別為0.2和0.1mg/L)，對人類表皮樣瘤KB細胞有類似作用(ICs分別為0.5和0.1ml/L)[6]。張琇研究團隊研究的海洋微生物溶菌酶S-12-86(MMLS)在體外具有廣譜的抗菌作用，并對偽狂犬病毒也有較強的抑制作用，有望開發(fā)成為一種新型的抗菌抗病毒新藥，有較大的開發(fā)潛力[7]。海洋微生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要成員,參與海洋中物質(zhì)循環(huán),在消除海洋污染物質(zhì),海洋自凈中起著重要作用,稱為“海洋清潔工”。已發(fā)現(xiàn)200多種能氧化一種或多種水體污染物的微生物,某些霉菌和放線菌去除無機氰化物效率可達到90%以上,分解酚類化合物的能力一般都在95%以上[8]。1.2紅樹林及紅樹內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀紅樹林是高產(chǎn)、動態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，生長在熱帶和溫帶的潮間帶。這些木本樹木或灌木十分重要，因為它們遍布全球，生產(chǎn)力高[9]。紅樹林生長在熱帶亞熱帶低能海岸潮間帶,受周期性海水浸淹,且以紅樹植物為主體的常綠灌木或喬木組成的潮灘濕地木本生物群落,屬常綠闊葉林,主要分布于淤泥深厚的海灣或河口鹽漬土壤上。它們是陸地顯花植物進入海洋邊緣演化而成,占據(jù)于海岸生態(tài)關鍵區(qū),適應于特殊環(huán)境,從而具有特殊化的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生態(tài)特性[10]。研究證明微生物和紅樹林植物形成微生物-營養(yǎng)-紅樹林植物的密切關系,主要用于紅樹林生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)物質(zhì)的維持和循環(huán)。植物內(nèi)生真菌是指分布在沒有外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)的真菌,它與宿主植物協(xié)同進化,具有重要的生物學功能。內(nèi)生菌存在于植物的組織內(nèi)，對寄主植物無害；內(nèi)生微生物在其寄主植物組織內(nèi)合成的生物活性化學物質(zhì)，對植物有益，這引發(fā)了關于植物與微生物關系的廣泛研究[11]。通過對內(nèi)生真菌的研究可以探尋其與植物宿體生長發(fā)育間存在的聯(lián)系規(guī)律，內(nèi)生真菌從植物中獲取養(yǎng)分，同時分泌代謝產(chǎn)物影響著植物體的生長發(fā)育。部分真菌可以分泌能夠提高植物體抵抗力、增強植物體抗逆性的次生代謝物[12]，有的真菌還具有生態(tài)功能，可對宿主植物產(chǎn)生對生境適應性以及物質(zhì)與能量應用上的影響[13]。研究員在對紅樹內(nèi)生真菌的研究中取得了許多的成果。Poch在研究過程中，首次在紅樹林的植物真菌PmrssiaaurantiaraATCC14745樣本上發(fā)現(xiàn)了2種新縮酚酸環(huán)醚，即auranticinsA和B，它們有著明顯的抗菌作用[14]。Hypothemycin，由Isaka和其他研究人員發(fā)現(xiàn)，來自于子囊屬真菌AigialusparvusBCCstrain5311的一類十四元間羥苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯類新化合物[15]。實驗證實，它們能夠高度選擇且不可逆地抑制三磷酸腺苷結(jié)合盒中的帶有半胱氨酸殘基的激酶,并且能夠產(chǎn)生長期而穩(wěn)定的抑制效果[16,17]。通過對半紅樹林植物水黃皮的研究，Shang等成功地提取出了1株內(nèi)生黑孢霉屬真菌Nigrosporasp.No.MA75,通過培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)后，分離純化得到1個新的cochlioquinone衍生物、1個已知的氧雜蒽酮衍生物和1個已知物griseophenoneC[18]。Wang等在紅海欖內(nèi)生木賊鐮刀菌FusariumequisetiAGR12的發(fā)酵提取物中分離得到2個已知的環(huán)狀乙酰型植物毒素equisetin和epiequisetin，并且都表現(xiàn)出了中等強度的抗細菌活性[19,20]。紅樹內(nèi)生微生物抗菌活性成分研究尚處在探索時期,基于基因組分析先導物的發(fā)現(xiàn)(genome-baseddrugdiscovery),多學科交叉研究與合成生物學技術(syntheticbiologyfordrugdiscovery)、及時PCR技術(naturalproductdiscoverybyahigh-throughputrealtimePCRmethod)、組合生物合成(combinatorialbiosynthesisformicrobialnaturalproducts)和及時在線分析技術(directanalysisinrealtimebymassspectrometrictechnique)等科學研究方法技術的突破,結(jié)合對我國紅樹林的深入探索，紅樹內(nèi)生真菌資源可以成為供科學家們探索的全新的、無限可能的科學寶藏。因此，在保護和合理使用的前提下，應當積極探索和研究，以期獲得一系列擁有我國自主知識產(chǎn)權的、可持續(xù)的、高效的紅樹林微生物抗菌類藥物[21]。1.3研究目的與意義紅樹林伴生真菌作為海洋真菌的第二大生態(tài)類群，不僅在創(chuàng)造和維持該生物圈方面發(fā)揮著至關重要的作用，而且是結(jié)構(gòu)獨特和多樣化的生物活性次生代謝產(chǎn)物的豐富來源，具有重要的研究價值。據(jù)報道，紅樹林的微生物可以通過不同的方式生成各種不同的代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可能是生物堿、雜環(huán)生物堿或大環(huán)生物堿。此外，還可能是環(huán)肽、醌、萜、聚醚、甾醇、多糖和不飽和脂肪酸。這些物質(zhì)都可能對人體和動物造成不同的影響，例如抑制疾病的生長、殺滅害蟲、抑制酶的作用、提高免疫力和減少癌癥風險。因此，我們研究者們還需要進一步深入了解這些物質(zhì)的作用機制。本實驗利用課題組前期優(yōu)化的培養(yǎng)條件對從紅樹植物海桑樹葉內(nèi)分離出的一株紅樹內(nèi)生真菌進行大規(guī)模培養(yǎng)，并對其代謝產(chǎn)物的豐富度進行分析，為后續(xù)分離純化，尋找新型或活性良好的化合物奠定基礎，為尋找新藥開拓新路徑。2材料與方法2.1實驗儀器與材料表1實驗儀器及生產(chǎn)廠家實驗儀器生產(chǎn)廠家高壓蒸汽滅菌器（DSX-24L-I）上海申安醫(yī)療器械廠恒溫恒濕培養(yǎng)箱（SPX-250C）上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠恒溫鼓風干燥箱（GZX-9240MBE）上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠電子分析天平（ALB-224）太倉市實驗設備廠搖床（TCYQ）太倉市實驗設備廠數(shù)控超凈工作臺（TOP-870）廣潔凈化設備有限公司恒溫水浴鍋（HH-2）浙江金壇市宏華儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）上海亞榮生化儀器廠循環(huán)水式真空泵（SHB-III）鞏義市予華儀器有限責任公司三用紫外儀（ZF-2）上海市安亭電子儀器廠點樣毛細管（0.3*100mm）上海申立玻璃儀器廠表2實驗材料和生產(chǎn)廠家實驗材料名稱生產(chǎn)廠家乙酸乙酯(AR)廣東光華科技股份有限公司甲醇(AR)廣東光華科技股份有限公司二氯甲烷(AR)廣東光華科技股份有限公司馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)廣東環(huán)凱微生物科技有限公司葡萄糖廣東環(huán)凱微生物科技有限公司海鹽淄博海力通鹽化有限公司薄層層析硅膠GF-254青島海洋化工有限公司羧甲基纖維素鈉(AR)天津市大茂化學試劑廠蛋白胨廣東環(huán)凱微生物科技有限公司酵母浸膏廣東環(huán)凱微生物科技有限公司2.2真菌來源本次實驗選取的研究對象是從紅樹植物海桑樹葉中分離提純的編號為1512107的內(nèi)生真菌。2.3培養(yǎng)基的配制2.3.1PDA平板培養(yǎng)基的配制首先，徹底清潔培養(yǎng)皿，并將其放入高壓蒸汽滅菌鍋中進行滅菌處理。在進行滅菌處理時，將滅菌條件設置為121℃、0.1Mpa，滅菌時間設置為30min，以確保培養(yǎng)皿內(nèi)部雜菌完全被殺滅。滅菌結(jié)束后，打開排氣閥門，待滅菌鍋壓力降至0Mpa后從里面取出培養(yǎng)皿，并放進鼓風干燥箱60℃進行干燥，直到培養(yǎng)皿完全干燥。接著，用電子分析天平精密稱取6g馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）粉末，將稱好的PDA粉末倒進小燒杯中。用量筒量取150mL去離子水，加入小燒杯中，邊加邊利用玻璃棒不斷攪拌，直到瓊脂粉末完全溶解。溶解后將溶液倒入500mL干燥清潔完全的錐形瓶中，并用封口膜進行密閉封口。封口后，用橡皮筋將錐形瓶綁緊，以防止雜菌進入培養(yǎng)基。最后，將配制好的培養(yǎng)基放進高壓蒸汽滅菌鍋中，滅菌30min。滅菌結(jié)束后，打開排氣閥門，待滅菌鍋壓力降至0Mpa后從里面取出培養(yǎng)基，得到PDA培養(yǎng)液。隨后，將烘干的培養(yǎng)皿放入超凈工作臺，用75%的酒精對工作臺進行滅菌處理，提前打開紫外燈30min，確保超凈工作臺內(nèi)的雜菌被完全殺滅。然后關閉紫外燈，使用75%酒精噴灑雙手消毒，保證酒精完全揮發(fā)完畢后，點燃酒精燈，并將兩盞酒精燈并列放置。確保每個培養(yǎng)皿在兩盞酒精燈火焰之間，并提前在火焰上方將培養(yǎng)皿的開口邊緣進行灼燒。然后稍稍打開培養(yǎng)皿，在開口處倒入約15mLPDA培養(yǎng)液，倒完后將培養(yǎng)皿放到超凈工作臺邊上靜置。重復上述操作4次，操作完畢后再次打開紫外燈進行滅菌處理30min。待培養(yǎng)基凝固后倒扣，防止冷凝液滴落污染培養(yǎng)基。待冷卻后，得到4個PDA平板培養(yǎng)基。2.3.2大米培養(yǎng)基的配制將海鹽和去離子水以3g:1000mL的比例溶解，得到0.3%的海鹽水。于500mL錐形瓶中加入大米40g，0.3%海鹽水75mL，振搖使其完全混合，隨后在瓶口外壁封上封口膜，用橡膠繩將錐形瓶外壁固定，以阻止外界的雜菌侵入。將錐形瓶放進高壓蒸汽滅菌鍋中，設置滅菌條件為121℃、0.1Mpa，滅菌時間設置為30min。滅菌結(jié)束后，打開排氣閥門，待滅菌鍋壓力降至0Mpa后從里面取出錐形瓶。重復上述步驟制備200瓶大米培養(yǎng)基。2.3.3PYG液體培養(yǎng)基的配制在稱量室中使用分析天平稱取適量蛋白胨2g/L，葡萄糖10g/L，海鹽2g/L，酵母膏1g/L，將它們混合后倒入2L的燒杯中，往燒杯中加入2000mL去離子水并用玻璃棒不斷攪拌，待溶液顯示深黃色透明液體即表示完全溶解。然后將混合好的液體倒入已清洗干凈的500mL錐形瓶中，每瓶分裝250mL，用封口膜將瓶口封好，用麻繩綁緊并做好標簽。最后，將錐形瓶放入高溫蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在121℃和0.1MPa的條件下滅菌30分鐘。滅菌結(jié)束后，打開排氣閥門，待滅菌鍋壓力降至0Mpa后從里面取出錐形瓶，讓其冷卻至室溫即可得到PYG液體培養(yǎng)基。2.4菌種的活化將編號為1512107斜面保存管從實驗室冰箱中取出，置于室溫條件下活化半小時。在確保超凈工作臺已經(jīng)經(jīng)過30min紫外燈消毒處理后，關閉紫外燈，用75%酒精消毒雙手。將兩盞酒精燈并列放置，隨后點燃酒精燈，將接種環(huán)置于火焰上灼燒至通紅，靜置冷卻后，在火焰上方打開斜面保存管，刮取斜面保存管中少量活化菌絲體，并將其接種在PDA平板培養(yǎng)基中心位置，注意菌絲體面朝上。重復上述步驟四次，共接種4個PDA平板培養(yǎng)基，接種完成后標上接種日期、菌株編號及名稱。將培養(yǎng)皿置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒扣培養(yǎng)，將恒溫恒濕培養(yǎng)箱的溫度設置為28℃，濕度設置為50%，培養(yǎng)3-5天后觀察真菌生長情況，拍照并記錄。2.5種子培養(yǎng)液的配制從恒溫恒濕培養(yǎng)箱取出裝有活化后菌種的PDA平板培養(yǎng)基，選擇無雜菌污染，生長情況良好的PDA培養(yǎng)基用于制備種子液。提前打開紫外燈在確保超凈工作臺消毒30min以上完全消滅雜菌后，關閉紫外燈，用75%酒精消毒雙手，待酒精揮干后，將培養(yǎng)基放進超凈工作臺內(nèi)，點燃酒精燈，將兩盞酒精燈并列放置，接種環(huán)在酒精燈火焰上進行灼燒、靜置冷卻后劃取適量活化菌絲體，使其垂直接種于含有250mlPYG液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，避免粘在培養(yǎng)基內(nèi)壁中，同時注意接種環(huán)不能碰到瓶口。用封口膜密閉封口，并用橡皮筋綁緊瓶口，重復上述步驟5次，作為種子培養(yǎng)液。接菌完成后設定搖床條件為120r/min，保持溫度為28℃條件下開啟搖床，培養(yǎng)4-5天，觀察菌絲體生長情況，拍照并記錄。2.6擴大培養(yǎng)啟動紫外燈預照射30min超凈操作臺，隨后將燈關掉，接著使用75%的酒精對雙手進行消毒處理，選擇無雜菌污染，菌絲體生長情況良好的種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液及大米培養(yǎng)基放進超凈工作臺內(nèi)，點燃酒精燈，將兩盞酒精燈并列放置，將約5mL種子液倒入已完成高溫滅菌并冷卻得到的大米培養(yǎng)基中，使用封口膜密閉封口，并用橡皮筋綁緊瓶口。重復接種兩百瓶大米培養(yǎng)基，并在室溫靜置發(fā)酵一個月，觀察菌株的發(fā)酵情況，拍照并記錄。2.7代謝產(chǎn)物的提取與萃取向大米發(fā)酵產(chǎn)物中加入適量甲醇，少量多次，每次浸泡約24h，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液用三層醫(yī)用紗布過濾得到甲醇浸泡液和菌餅，過濾得到的甲醇浸泡液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行第一次濃縮，待液體蒸干后用甲醇將濃縮液洗出，得到第一次濃縮液。將蒸發(fā)得到的第一次濃縮液置于水浴鍋中，設置水浴鍋溫度為60℃進行第二次濃縮，得到黏稠狀濃縮液。往濃縮液中加入少量去離子水，防止?jié)饪s液過于黏稠，阻礙萃取。攪拌均勻后，用等體積的乙酸乙酯對濃縮液進行萃取，多次萃取后有機層呈現(xiàn)接近無色，說明萃取基本完成，合并有機相。提前準備好一個100mL的燒杯并稱重，將有機相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，得到粗提取物，用少量乙酸乙酯將其洗出后用膠頭滴管吸出，滴到燒杯內(nèi)，將得到的濕浸膏通風揮干，直到重量不再變化，即為最后的浸膏。稱重，計算產(chǎn)量。2.8薄層色譜分析2.8.1制備薄層硅膠板將研缽、薄層玻璃板洗凈備用，同時準備薄層層析硅膠粉和羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，把CMC-Na和硅膠粉按照合適的配料比加入到研缽中，沿順時針方向（沿同一方向）研磨30min，直到混合溶液呈乳白色且不出現(xiàn)氣泡，在研杵上呈線狀滴落，代表研磨完成。用勺子舀上小半勺鋪在薄層玻璃板上，轉(zhuǎn)動薄層板直到硅膠漿充滿整塊板。待鋪好的硅膠板自然晾干后，放到溫度為105℃的鼓風干燥箱中進行活化，30min后取出，備用。2.8.2點板配制10%甲醇/二氯甲烷溶液作為展開劑，將展開劑倒入展開缸中，提前讓展開缸內(nèi)的氣體飽和。取少量上述制得的浸膏于西林瓶中，加入甲醇使浸膏溶解，用棉花進行過濾，除掉雜質(zhì)，用0.3*100mm毛細管吸取部分樣品（約為毛細管長度的1/5）輕點在薄層硅膠板上，將薄層硅膠板放進飽和的展開缸中進行展開。待展開劑上升至硅膠板約2/3處時，取出硅膠板。靜置使硅膠板上的展開劑揮干后，分別在254nm紫外燈和365nm紫外燈下觀察并拍照記錄。觀察并記錄完畢后把硅膠板放進碘缸中進行碘顯色，顯色完畢后同樣分別在254nm紫外燈和365nm紫外燈下觀察，拍照記錄碘熏后的樣品，判斷樣品點的個數(shù)，并判斷代謝產(chǎn)物豐富度。

3結(jié)果3.1菌種活化四天后的情況菌種1512107培養(yǎng)四天后的活化情況如下圖（圖1），觀察發(fā)現(xiàn)菌種明顯從中心向四周生長，形成單一菌落。菌落的質(zhì)地呈致密絨狀，菌落表面有放射狀溝紋，邊緣為白色。菌種正常長出菌落，長勢良好，無雜菌污染，可以進行接種。圖1菌種1512107活化四天后的菌落形態(tài)3.2種子培養(yǎng)液培養(yǎng)五天后的情況菌種1512107接種后的種子培養(yǎng)液培養(yǎng)五天后的情況如下圖（圖2），觀察發(fā)現(xiàn)菌液澄清透明，呈淡橙黃色，菌絲體呈白色絲狀，菌落整體呈球狀分散排布，長勢良好，無雜菌污染，可以進行擴大培養(yǎng)。圖2菌株1512217接種后種子培養(yǎng)液培養(yǎng)5天后的生長情況3.3大米培養(yǎng)基發(fā)酵30天后的情況菌種1512107擴大培養(yǎng)發(fā)酵30天后大米培養(yǎng)基的情況如下圖（圖3），觀察發(fā)現(xiàn)上層被白色絨毛覆蓋，下層為大米發(fā)酵長成的黑色完整菌餅，長勢良好，無雜菌污染，可以進行提取。圖3菌株1512107發(fā)酵培養(yǎng)30天后的生長情況3.4代謝產(chǎn)物產(chǎn)量以菌種1512107作為本次實驗研究的目標菌株，對其進行大規(guī)模培養(yǎng)得到200瓶大米培養(yǎng)基，經(jīng)過提取、萃取、濃縮后得到的63g代謝產(chǎn)物浸膏如下(圖5)，為后續(xù)實驗的實施和最后實驗數(shù)據(jù)的獲取奠定基礎?？偨嘀亓砍鲱A期結(jié)果（35g），由此推斷本次實驗使用的方法適合用于提取內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中的活性成分。圖4菌株1512107菌絲體浸膏3.5真菌1512107代謝產(chǎn)物薄層層析色譜結(jié)果菌種1512107發(fā)酵提取后的浸膏使用20%CH3OH/CH2Cl2作為展開劑展開后，得到的薄層色譜圖情況如下（圖4）。圖中從左到右依次為254nm紫外燈(a)，365nm紫外燈(b)，碘顯色(c)下的色譜圖。因為20%CH3OH/CH2Cl2試劑的極性較大，所以在硅膠板上移動地最遠的成分極性反而越小。在254nm紫外光下的硅膠板大致可分出四個點a1,a2,a3,a4.其中a1極性最大，a4極性最小。極性越小的成分越容易分離出來。在365nm紫外光照射下的硅膠板上所呈現(xiàn)出的色譜圖較為明顯，可以看出有5個亮點，極性從大到小依次為b1,b2,b3,b4和b5。其中可以明顯看出b5最為顯色，表明其中存在多種且復雜的化合物，代謝產(chǎn)物豐富度較高；b1處在極性較大的區(qū)域，需要進一步分離。圖3進行碘色法處理的硅膠板可看出大概分出3個點，為c1,c2,c3。c2對應b3,c3對應b5,而b1,b2和b4在c圖中沒有顯示出來，c1在b圖中沒有顯示出來，故需要進一步分離。abc圖5內(nèi)生真菌1512107代謝產(chǎn)物的薄層色譜圖

4討論在這次實驗中發(fā)現(xiàn)200瓶大米培養(yǎng)基中有4瓶菌餅與其他196瓶的外觀、形態(tài)、顏色等與結(jié)果描述的情況不一致，從而判斷這4瓶培養(yǎng)基受到了不同程度的雜菌污染，染菌率為2%。反觀從菌種活化到大米培養(yǎng)基的制備，再到種子培養(yǎng)液的制備過程中均未發(fā)現(xiàn)雜菌污染的情況，進而推斷出雜菌污染出現(xiàn)在擴大培養(yǎng)步驟。污染原因：通過對整個擴大培養(yǎng)操作的回顧，初步判斷為本人在把種子液倒入大米培養(yǎng)基過程中，有幾瓶未能及時用封口膜封口；以及封口后封口膜未用橡皮筋捆綁嚴實導致封口膜漏氣，導致培養(yǎng)基被空氣中的細菌污染。建議：應保證在無菌環(huán)境下打開封口膜，打開封口膜后要及時進行接種，減少被污染的概率；接種過程要在兩盞酒精燈中間進行，接種完畢后要快速封口；封口完畢后還要注意檢查封口膜是否完整密閉，橡皮筋是否捆綁嚴實，確保擴大培養(yǎng)過程中不會被外來雜菌污染。從薄層色譜結(jié)果可知硅膠板上顯色明顯且色帶多，表明代謝產(chǎn)物的豐富度高，色帶分布間隔較小表明代謝產(chǎn)物分布不均勻。由于在用甲醇提取發(fā)酵液及用乙酸乙酯萃取濃縮液時，得到的液體顏色較深，故推測菌絲體浸膏中含有大量的色素成分，這些成分極性小，薄層色譜Rf值小。本實驗用薄層色譜分析方法對代謝產(chǎn)物豐富度進行初步的分析，即根據(jù)各化合物極性的差異進行初步判斷，得到的樣品點的個數(shù)為在該展開系統(tǒng)下化合物極性不相似的個數(shù)，并不能準確判斷樣品的豐富度，代謝產(chǎn)物仍需進一步分離純化，如使用正反相硅膠色譜法等方法，可以分離純化得到單體化合物；通過高效液相色譜法等方法得到的色譜圖進行分析，判斷分離出的化合物的含量；通過質(zhì)譜、碳譜等方法分析化合物的元素組成及位置關系。

5結(jié)論本次實驗所采用的研究對象海桑樹葉內(nèi)生真菌，由于紅樹林獨特的生長環(huán)境具有豐富的多樣性，成為現(xiàn)代海洋天然產(chǎn)物領域的一大熱點。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)近年來已經(jīng)有研究人員發(fā)現(xiàn)紅樹內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗瘤、抗病毒的活性，但是國內(nèi)外對于海桑樹葉內(nèi)生真菌的研究卻鮮有報道。因此，本次實驗選取了從海桑樹葉中分離出的真菌1512107作為研究對象，并對其代謝產(chǎn)物進行分析，有助于后續(xù)開展深入研究。從內(nèi)生真菌的樣品庫中選取一株從海桑樹葉中分離出的真菌1512107進行活化后使用PDA培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的菌株用于制備種子液。再用大米培養(yǎng)基進行大規(guī)模發(fā)酵，用甲醇少量多次浸泡菌餅得到甲醇浸泡液，第一次濃縮得到濃縮發(fā)酵液，再用乙酸乙酯萃取、第二次濃縮得到浸膏并稱其重量。取少量浸膏進行點板分析，薄層色譜結(jié)果顯示樣品點顯色明顯，色帶多且雜，表明代謝產(chǎn)物豐富度較高。通過本次研究證實，內(nèi)生真菌的發(fā)酵周期短，成本低，但得到的代謝產(chǎn)物豐富、回收率高、產(chǎn)量大。由此推斷本次實驗所采用的培養(yǎng)、發(fā)酵方法適用于本次的研究對象。通過薄層色譜法證實其豐富度高也為后續(xù)發(fā)現(xiàn)新的活性代謝產(chǎn)物奠定基礎，為新型藥物合成研發(fā)提供了新的思路。

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