尼古丁對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的干預(yù)作用及機制研究

尼古丁對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的干預(yù)作用及機制研究關(guān)節(jié)軟骨缺損是指累及軟骨表層甚至軟骨下骨的軟骨損傷,可由創(chuàng)傷、退行性變、贅生物、先天性畸形等引起。創(chuàng)傷是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨缺損的最常見原因,主要是由于運動或意外事故造成。隨著競技體育日趨激烈、交通日益發(fā)達以及人口老齡化問題的日漸突出,使得罹患關(guān)節(jié)軟骨缺損的病例不斷增加。由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管神經(jīng)支配的組織學(xué)和生物學(xué)特性限制了其自我修復(fù)能力,軟骨缺損的治療一直是臨床骨科醫(yī)生面臨的難題。關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)尤其是對較大面積缺損的修復(fù),尚缺乏理想的方法,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和組織工程學(xué)的興起,使關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)取得了一定的進展。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells,BMSCs)具有增殖能力強,可多向分化,且采集方便、對機體損傷小的特點,是軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞。應(yīng)用BMSCs進行回植誘導(dǎo)分化修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損取得了良好的臨床效果。然而,目前的研究大多集中于如何更有效促進BMSCs的軟骨分化,如何提高BMSCs的軟骨修復(fù)效果,對于BMSCs軟骨分化中的不良暴露因素的研究甚少。當(dāng)前,我國已成為全球最大的煙草生產(chǎn)國,吸煙人口亦居世界第一,因吸煙所致的各種疾病及死亡人數(shù)逐年上升。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),尼古丁濫用是影響自體軟骨細(xì)胞移植修復(fù)軟骨缺損臨床效果的不良因素之一,但其是否同樣可影響B(tài)MSCs的軟骨缺損修復(fù)尚未見報道。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),尼古丁持續(xù)暴露4周可顯著抑制大鼠BMSCs體外軟骨定向分化中的蛋白多糖合成和軟骨標(biāo)志基因表達,但其具體機制仍不明確。Y染色體性別決定結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(SRY-typehighmobilitygroupbox9,Sox9)是軟骨形成的起始因子,在軟骨發(fā)生和發(fā)育過程中與軟骨表型基因的增強子區(qū)結(jié)合,促進軟骨表型基因表達并維持軟骨細(xì)胞特性。α7煙堿受體(α7nicotinicacetylcholinereceptor,α7-nAchR)是一類存在于MSC中典型的離子通道,可調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CaN)是唯一受Ca2+調(diào)控的磷酸酶,其活化可調(diào)節(jié)活化的T細(xì)胞核因子2(nuclearfactorofactivatedTcell2,NFATc2)的磷酸化狀態(tài),進而調(diào)控下游信號通路的功能。表遺傳修飾是指影響基因轉(zhuǎn)錄活性而不涉及DNA序列改變的基因表達調(diào)控方式,其最常見的形式為組蛋白乙?；揎?。組蛋白乙?；癄顟B(tài)主要由組蛋白乙?；揎椕刚{(diào)控,與基因的表達調(diào)控密切相關(guān),組蛋白乙酰化酶和去乙?；钢g的動態(tài)平衡維持著基因的正常表達。因此,我們認(rèn)為尼古丁可能通過a7-nAchR調(diào)節(jié)Ca2+/CaN/NFAT通路,導(dǎo)致Sox9表遺傳發(fā)生變化,進而影響B(tài)MSCs的軟骨分化。本研究首先從動物水平證實尼古丁對BMSCs修復(fù)軟骨缺損的不良干預(yù)作用,其機制可能是通過抑制Sox9的表達實現(xiàn)其干預(yù)作用。然后在前期研究的基礎(chǔ)上,從細(xì)胞水平證實尼古丁通過表遺傳修飾抑制Sox9表達進而影響B(tài)MSCs軟骨分化的分子機制。進一步利用工具藥及RNA干擾技術(shù),闡明尼古丁抑制BMSCs軟骨分化的可能的分子靶標(biāo)。本研究對于尼古丁依賴人群軟骨缺損臨床治療風(fēng)險評估,指導(dǎo)個性化治療方案,最大程度上避免尼古丁對BMSCs軟骨修復(fù)的不利影響,實現(xiàn)高質(zhì)量的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù),具有重要的理論和現(xiàn)實意義,同時也為指導(dǎo)軟骨組織工程在臨床中應(yīng)用提供研究依據(jù)。第一部分尼古丁對大鼠BMSCs修復(fù)軟骨缺損的干預(yù)作用研究目的：通過大鼠軟骨缺損模型,證實尼古丁對BMSCs軟骨缺損修復(fù)的干預(yù)作用,該干預(yù)作用可能通過抑制Sox9表達實現(xiàn)。方法：全骨髓貼壁法分離提取Wistars大鼠BMSCs,傳代培養(yǎng)至第三代。取12周齡Wistars大鼠40只,雌雄各半,給予10%水合氯醛(3.5ml/Kg)腹腔注射麻醉,于右側(cè)股骨滑車處制做直徑3.0mm,深度1.5mm的軟骨缺損模型。將大鼠隨機分為4組：缺損對照組(Non-treated):軟骨缺損造模后未給予任何修復(fù)處理；凝膠修復(fù)組(Alginate):軟骨缺損造模并海藻酸鈉凝膠修復(fù)；凝膠+干細(xì)胞修復(fù)組(BMSCs):軟骨缺損造模并復(fù)合BMSCs的海藻酸鈉凝膠修復(fù)；凝膠+干細(xì)胞修復(fù)+尼古丁處理組(Nicotine):軟骨缺損造模并復(fù)合BMSCs的海藻酸鈉凝膠修復(fù),術(shù)后每日分2次給予總量為2.0mg/kg的尼古丁皮下注射。術(shù)后3月麻醉下處死大鼠并取股骨遠(yuǎn)端標(biāo)本,取部分標(biāo)本先觀察缺損修復(fù)的大體觀并行ICRS評分,后制做切片予以組織病理學(xué)檢測,評估缺損修復(fù)效果并行組織學(xué)評分。免疫組化檢測修復(fù)組織中Col2A1、Sox9表達。剩余標(biāo)本取缺損處修復(fù)組織,提取總RNA,PCR檢測軟骨表型基因(Col2A1和Aggrecan)及Sox9表達。結(jié)果：大體觀與組織學(xué)檢測顯示,缺損對照組可見修復(fù)的軟骨組織,深度與周圍軟骨基本平齊,軟骨表面可見明顯的缺損及潰瘍；HE及番紅固綠染色可見修復(fù)組織為纖維軟骨樣組織,基質(zhì)染色明顯變淺。凝膠修復(fù)組可見部分修復(fù)的軟骨組織,面積為缺損的1/2以上,深度接近周圍正常軟骨,軟骨表面可見較大的裂隙存在；HE及番紅固綠染色未見基質(zhì)染色,修復(fù)組織為非軟骨組織。凝膠+干細(xì)胞修復(fù)組軟骨缺損完全修復(fù),深度與周圍軟骨平齊；軟骨表明光滑；HE及番紅固綠染色可見其為透明軟骨組織,軟骨基質(zhì)染色與周圍正常軟骨無差異。凝膠+干細(xì)胞修復(fù)+尼古丁處理組軟骨缺損基本修復(fù),深度基本與周圍軟骨平齊；軟骨表面未見明顯缺損,部分呈纖維軟骨樣改變；HE及番紅固綠染色可見大部分為透明軟骨樣組織,軟骨基質(zhì)染色較周圍正常軟骨淺。ICRS評分顯示凝膠+干細(xì)胞修復(fù)組高于其他組(P<0.05),組織學(xué)評分顯示凝膠+干細(xì)胞修復(fù)組低于其他組(P<0.05)。免疫組化染色顯示,缺損對照組修復(fù)組織中Col2A1染色較淡,Sox9陽性染色細(xì)胞數(shù)量少；凝膠修復(fù)組Col2A1未見染色,未見Sox9陽性染色細(xì)胞；凝膠+干細(xì)胞修復(fù)組染色明顯,Sox9陽性染色細(xì)胞數(shù)量較多；凝膠+干細(xì)胞修復(fù)+尼古丁處理組染色Col2A1也較淡,Sox9陽性染色細(xì)胞數(shù)量較少。光密度分析結(jié)果表明,凝膠+干細(xì)胞修復(fù)組Col2A1、Sox9的MOD值較凝膠+干細(xì)胞修復(fù)+尼古丁處理組高(P<0.01,P<0.05)。軟骨表型基因mRNA表達顯示,凝膠+干細(xì)胞修復(fù)組Col2A1、Aggrecan及Sox9的mRNA表達均高于凝膠+干細(xì)胞修復(fù)+尼古丁處理組(P<0.05)。結(jié)論：海藻酸鈉凝膠復(fù)合BMSCs移植可良好修復(fù)軟骨缺損,尼古丁可對其修復(fù)效果產(chǎn)生不利影響,不良干預(yù)作用可能通過抑制Sox9表達實現(xiàn)。第二部分尼古丁抑制大鼠BMSCs軟骨分化的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究目的：在細(xì)胞水平證實尼古丁抑制BMSCs軟骨分化的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。方法：采用海藻酸鈉微球三維培養(yǎng)方法,對BMSCs進行軟骨誘導(dǎo)分化28天,分化過程中每日給予不同濃度(0、0.1、1、10、100(?)M)尼古丁處理,PCR檢測軟骨表型基因及Sox9的mRNA表達。取P3代BMSCs,提取蛋白及總RNA,PCR和WesternBlotting篩選驗證煙堿受體(nicotinicacetylcholinereceptor,nAchR)亞型。Fluo-3AM孵育BMSCs,給予上述不同濃度尼古丁處理,激光共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的時間與幅度,并采用發(fā)色底物法檢測細(xì)胞內(nèi)CaN活性變化。尼古丁分別處理BMSCs8h、16h及24h,檢測Sox9的表達變化,根據(jù)Sox9的表達發(fā)生變化的時間確定尼古丁處理時間。給予不同濃度尼古丁處理BMSCs驗證其表遺傳機制,提取總蛋白與核蛋白檢測NFATc2表達,提取漿蛋白,檢測磷酸化的NFATc2表達。進一步采用染色質(zhì)免疫共沉淀方法(chromatinimmunoprecipitation,ChIP)檢測Sox9基因啟動子區(qū)H3K9、H3K14乙酰化修飾、NFATc2與Sox9啟動子區(qū)結(jié)合以及Sox9與Col2A1增強子區(qū)結(jié)合情況,應(yīng)用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)檢測NFATc2與組蛋白去乙?；?(histonedeacetylase,HDAC1)的相互作用。結(jié)果：BMSCs上存在a7-nAChR.給予尼古丁刺激后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在5-10min內(nèi)呈濃度依賴性升高,CaN活性亦呈濃度依賴性增強(P<0.05)。尼古丁處理BMSCs24h后,Sox9表達明顯降低。胞核中去磷酸化的NFATc2表達升高(P<0.01,P<0.05),胞漿中磷酸化的NFATc2表達下降(P<0.01,P<0.05),細(xì)胞總蛋白中NFATc2表達無明顯差異。NFATc2與Sox9啟動子區(qū)結(jié)合增強(P<0.01,P<0.05),Sox9啟動子區(qū)組蛋白H3K9、H3K14乙酰化水平下降(P<0.01,P<0.05),Sox9與Col2A1增強子區(qū)結(jié)合下降(P<0.01,P<0.05)。HDAC1與NFATc2的結(jié)合增強。尼古丁處理導(dǎo)致的以上改變均呈現(xiàn)出濃度依賴性變化的特點。結(jié)論：尼古丁對BMSCs軟骨分化抑制的表遺傳調(diào)控機制主要是通過α7-nAChR使Ca2+濃度上升并活化CaN,使NFATc2去磷酸化入核,與Sox9啟動子區(qū)結(jié)合并招募HDAC1,從而使Sox9啟動子區(qū)乙?；陆狄种芐ox9表達,進而與Col2A1增強子區(qū)結(jié)合下降,使軟骨表型基因表達下降從而抑制軟骨分化。第三部分尼古丁抑制大鼠BMSCs軟骨分化的分子靶標(biāo)研究目的：利用α7-nAChR特異性抑制劑甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine,MLA)及Si-NFATc2在細(xì)胞水平確證尼古丁抑制BMSCs軟骨分化的分子靶標(biāo)。方法：取P3代BMSCs按第二部分方法進行軟骨誘導(dǎo)分化28天,隨機分為4組：對照組(Control):給予正常軟骨分化培養(yǎng)；尼古丁處理組(Nicotine):每日給予100(?)M尼古丁處理；(3)MLA處理組：每日給予10(?)M的MLA處理；(4)MLA+尼古丁處理組：每日先給予MLA處理0.5h,再給予100(?)M尼古丁處理。檢測軟骨表型基因及Sox9的mRNA表達,番紅O和阿利新藍(lán)特殊染色進行形態(tài)學(xué)檢測。為進一步明確分子機制的作用靶標(biāo),將BMSCs分為4組：對照組(Control):給予正常軟骨分化培養(yǎng)24h；尼古丁處理組(Nicotine):給予100(?)M尼古丁處理24h;Si-NFATc2處理組(Si)：先給予Si-NFATc2處理24h,再給予100(?)M尼古丁處理24h;MLA處理組(MLA)：先給予MLA處理0.5h,再給予100(?)M尼古丁處理24h。采用第二部分中方法檢測BMSCs中Ca2+濃度變化、Sox9基因啟動子區(qū)H3K9、H3K14乙酰化修飾、NFATc2與Sox9啟動子區(qū)結(jié)合、Sox9與Col2A1增強子區(qū)結(jié)合以及HDAC1與NFATc2的結(jié)合情況。結(jié)果：軟骨誘導(dǎo)分化28天后,與對照組相比,尼古丁處理組軟骨基質(zhì)阿利新藍(lán)及番紅O染色明顯變淺,MLA處理組及MLA+尼古丁處理組基質(zhì)染色無明顯變化；尼古丁處理組軟骨表型基因及Sox9的mRNA表達明顯下降(P<0.01),MLA處理組及MLA+尼古丁處理組無明顯變化。機制靶標(biāo)驗證結(jié)果顯示,尼古丁組Sox9的mRNA與蛋白表達明顯下降(P<0.01),Sox9表達無明顯變化。尼古丁處理后Ca2+濃度升高,MLA及尼古丁處理后Ca2+濃度無明顯變化。與對照組相比,尼古丁組Sox9啟動子