堿性磷酸酶比活力測(cè)定課件

實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶比活力測(cè)定1實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰富钚詼y(cè)定方法的一般原理方法測(cè)定堿性磷酸酶制備各步驟酶制劑比活力2實(shí)驗(yàn)原理酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反應(yīng)的能力?？梢杂迷谝欢l件下所催化的某一特定化學(xué)速度表示。酶催化反應(yīng)速度越快，酶活性越高，反之則愈低。底物減少量或生成物增加量酶促反應(yīng)速度v=

單位時(shí)間3

產(chǎn)物濃度

v=a/b

酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線反應(yīng)時(shí)間要真實(shí)反映出酶活力的大小，就應(yīng)該在產(chǎn)物生成量與酶反應(yīng)時(shí)間成正比的這一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行初速度的測(cè)定。

活力測(cè)定中應(yīng)注意的幾個(gè)問題(1)活力測(cè)定一般測(cè)定產(chǎn)物增加速度為好。(2)測(cè)活過程應(yīng)注意外界環(huán)境的影響。ab4方法：1.終止測(cè)定法（終點(diǎn)法）終止測(cè)定法是在酶和底物反應(yīng)達(dá)到預(yù)定的時(shí)間時(shí)，立即加入終止劑使酶變性，終止酶促反應(yīng)，在這段反應(yīng)時(shí)間里面，產(chǎn)物的生成量基本成線性增加，用這段反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的平均速率代替反應(yīng)初速率。2.動(dòng)力學(xué)分析法（連續(xù)監(jiān)測(cè)法或速率法）5堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，簡(jiǎn)稱為ALPase)廣泛存在于微生物界和動(dòng)物界。ALPase能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。6對(duì)-硝基苯磷酸二鈉法堿性磷酸酶催化對(duì)硝基苯磷酸鈉鹽(pNPP)水解反應(yīng)，以對(duì)-硝基苯磷酸二鈉（pNPP）為底物，在pH10.1的碳酸鹽緩沖液（含2mmol/LMg2+）的測(cè)活體系中檢測(cè)酶催化pNPP水解產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基苯酚（pNP）的量。產(chǎn)物pNP在405nm處有最大的吸收峰，可以根據(jù)OD405nm

值的增加計(jì)算酶活力的大小。反應(yīng)式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

無(wú)色黃色

可通過分光光度法測(cè)定產(chǎn)物pNP的含量，求出反應(yīng)速度v。

堿性磷酸酶7酶活力單位定義為：在37℃下，以0.5mmol/LpNPP為底物，在pH10.1的碳酸鹽緩沖液含2mmol/LMg2+的測(cè)活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1

molpNP的酶量定為1個(gè)酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。8磷酸苯二鈉法在pH10環(huán)境中，ALPase催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，苯酚與4-氨基安替比林反應(yīng)生成色素原，該色素原經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌亞衍生物。測(cè)定紅色物質(zhì)的吸光度就可以計(jì)算酶活性的大小。反應(yīng)式如下：

磷酸苯二鈉+H2O苯酚+磷酸氫二鈉苯酚+4-氨基安替比林

紅色醌亞胺衍生物堿性磷酸酶9操作方法1

對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（不做）：取15支試管編號(hào)，0號(hào)一支，1－7號(hào)各二支，按下列表格操作。管號(hào)01234567pNP含量(

mol)00.050.100.150.200.250.300.350.5

mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.60.7H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.20.1Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL

OD405nm以對(duì)硝基苯酚的絕對(duì)量(

mol數(shù))為橫坐標(biāo)，OD405nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求出pNP的克分子消光系數(shù)(

)值。＝8.80×103(mol/L)-1﹒cm-110管號(hào)空白1235mMpNPP(mL)各0.2mLNa2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mLH2O(mL)各0.50mL混勻，37℃，5分鐘

酶液（mL）/各0.1mL37℃，精確反應(yīng)10分鐘0.2mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL

酶液（mL）0.1mLOD405nm2酶活力的測(cè)定以0號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定各管的OD405nm值，從對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出產(chǎn)物的

mol數(shù)，算出酶活力。113蛋白濃度的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度。分離提取的三步酶制劑按一定比例用Tris-HCl緩沖液稀釋，稀釋倍數(shù)視溶液的蛋白濃度高低而定。（一般稀釋5-10倍）。124結(jié)果處理

計(jì)算：式中：A為稀釋倍數(shù)，B為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的pNP

mol數(shù)或者通過＝8.80×103(mol/L)-1﹒cm-1換算（B=4000×OD405/

)，t為反應(yīng)時(shí)間，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白mg數(shù)，V1為測(cè)定酶活力所用的酶量(mL數(shù))V2為測(cè)定蛋白濃度所用的酶量(mL數(shù))酶的比活力（U/mg）＝酶活力（U/mL）蛋白濃度（mg/mL）純化倍數(shù)=各步比活力/第一步比活力得率%=各步總活力*100/第一步總活力

13將測(cè)定的數(shù)據(jù)或計(jì)算結(jié)果用下表記錄。（此為例子）

步驟總體積

mL蛋白mg/mL總蛋白mg酶活力U/mL總活力U比活力U/mg純化倍數(shù)得率%勻漿過濾液4007.24

20.3

正丁醇處理上清液470

33.8

0.35飽和(NH4)2SO4上清液440

35.3

0.7飽和(NH4)2SO4沉淀溶解透析上清液40.3

314.7

DEAE-32酶液9.63.82

1002.2

SephadexG75酶液13.20.49

451.5

SephadexG200酶液6.80.21

509.3

14注意事項(xiàng)取液量一定要準(zhǔn)確。反應(yīng)時(shí)間一定要精確。加酶前后一定要將試劑混勻?？瞻讓?duì)照一定要先加NaOH，后加酶。移液管或微量移液器的使用比色杯的使用三步樣品一定要完全化凍才能進(jìn)行測(cè)定水浴15管號(hào)11'22'33'44'55'

加酶時(shí)間（min）0.5m1m1.5m2m2.5m3m3.5m4m4.5m5m加NaOH時(shí)間10.51111.51212.51313.51414.515反應(yīng)時(shí)間（min）1010101010101010101016微量移液器的使用吸液：調(diào)好量程后，用大拇指將按鈕按下至第一停點(diǎn)，然后將移液器的吸嘴垂直插入液面幾毫米，慢慢松開按鈕回原點(diǎn)，吸取所需液體。排液：吸嘴貼著容器壁，接著將按鈕按至第一停點(diǎn)，排出液體排出殘液：稍停片刻待剩余液體聚集后，繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)，吹出殘余的液體。最后松開按鈕。17設(shè)定量程時(shí)，切忌使移液器量程旋鈕超出其標(biāo)示的最小和最大量程。選用合適量程的移液器，不能用大量程的移液器移取小體積樣品。在將