《木麻黃青枯菌強致病性菌株篩選技術規(guī)程》

4DB44/TXXXXX—XXXX木麻黃青枯菌強致病性菌株篩選技術規(guī)程本文件規(guī)定了木麻黃青枯菌（Ralstoniasolanacearum）分離與純化、檢測鑒定方法、菌株鑒定、強致病性菌株篩選及菌種保存等技術要求。本文件適用于木麻黃屬植物強致病性青枯菌菌株的篩選。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，凡是注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.28-2013食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質量要求3術語與定義下列術語和定義適用于本文件。3.1青枯菌Ralstoniasolanacearum病害英文名：BacterialwiltofCasuarina；屬細菌界Bacteria，變形菌門Proteobacteria，β-變形菌綱Betaproteobacteria，伯克氏菌目Burkholderiales，伯克氏菌科Burkholderiaceae，青枯菌屬Ralstonia。病原菌通過根部從病株蔓延至健株，通過土壤、水流進行遠距離傳播。木麻黃青枯菌的其他信息參見附錄A。3.2強致病性Strongpathogenicability能讓木麻黃植株迅速感病死亡的能力。3.3褐梗小枝Brownlignifiedtwigs基徑2mm～5mm的褐色木質化小枝，具多分枝。3.4分枝Branch生長在小枝上的綠色枝條。3.5小苗seedling5DB44/TXXXXX—XXXX無性系苗或實生苗，50cm～70cm高。4原理與方法青枯病菌菌株間存在著顯著的致病性差異，且在木麻黃—青枯菌的病理系統(tǒng)中，木麻黃同時存在水平抗性與垂直抗性，利用不同接種方法、不同抗性植物材料與多菌株交互接種測定的方法，才能準確篩選出強致病性菌株。5儀器用具5.1儀器植物生長培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、電子天平（精度≤0.0001g）、生物顯微鏡（具照相系統(tǒng)）、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機(≥12000r/min）、PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、離心機、恒溫水浴鍋（30℃~95℃)、低溫冰箱、純水機、渦旋振蕩器、分光光度計、可調微量加樣器等。5.2用具鑷子、手術剪、解剖刀、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿、三角瓶、離心管、試管、接種針、接種環(huán)等。6培養(yǎng)基與試劑6.1培養(yǎng)基CPG培養(yǎng)基：按附錄B中的B.1規(guī)定執(zhí)行。TTC培養(yǎng)基：按附錄B中的B.2規(guī)定執(zhí)行。6.2試劑革蘭氏染色試劑：按附錄B中的B.3規(guī)定執(zhí)行。PCR檢測所需試劑：按附錄B中的B.4規(guī)定執(zhí)行。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）7病菌分離與純化7.1病株判斷小枝黃化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多；根系發(fā)黑腐爛；木質部局部或全部變褐色至黑褐色；樹皮?？v裂成潰瘍狀；壞死根莖有水浸臭味；根、主莖、側枝橫切面?zhèn)谟腥榘咨咙S褐色的細菌膿液溢出。7.2樣本采集挖出病根，剪取直徑0.5cm～1.5cm、木質部呈水漬狀或半透明狀主根或側根2段～3段，每段10cm~20cm，封口袋封裝，記錄采集時間、地點，帶回實驗室分離病菌。7.3病菌分離6DB44/TXXXXX—XXXX7.3.1稀釋分離法取病根（約3cm），自來水洗凈，75％的酒精浸泡消毒30s，置無菌水沖洗3次，每次30s，在超凈工作臺上剝去外皮，置于無菌培養(yǎng)皿中切除兩端，最后將其橫切成3份～5份，放入含有5ml～10ml無菌水的培養(yǎng)皿內30min，攪拌形成病菌懸浮液。用接種環(huán)蘸取菌液在TTC培養(yǎng)基平板上劃線分離，至少3個平板，編號，于30℃下恒溫培養(yǎng)24h～48h。7.3.2根系溢出法將8cm～10cm長的病根洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面，把其中一端浸泡于裝有無菌水中的玻璃瓶中，室溫放置12h～36h后，在病根的另一端斷面會流出乳白色的菌膿。用接種針挑取菌膿劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基平板上，至少3個平板，編號，置于30℃下恒溫培養(yǎng)24h～48h。7.4病菌純化在培養(yǎng)皿內挑取不規(guī)則圓形，乳白色、中心部位粉紅色，具有流動性的單菌落，接種于TTC培養(yǎng)基平板上，30℃條件下擴大培養(yǎng)36h～48h，每個菌落接種3個培養(yǎng)皿并編號。7.5病菌培養(yǎng)7.5.1固體培養(yǎng)接種于TTC或CPG固體培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24h～48h。7.5.2液體懸浮培養(yǎng)將分離純化后的青枯病菌接種于三角瓶中，CPG液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基體積不超過三角瓶容積的1/2，150r/min～200r/min，30℃條件下培養(yǎng)12h～24h。8檢測鑒定8.1菌落特征在TTC固體培養(yǎng)基平板上菌落呈不規(guī)則圓形，略隆起，白色或乳白色，中心部位淡紅色或粉紅色（有的中央部位出現(xiàn)螺旋樣紅色沉著），不透明，具有流動性。8.2形態(tài)特征青枯菌菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（1.5μm～2.5μm）×（0.5μm～0.7μm），多數(shù)無鞭毛，少數(shù)具1根～3根極生鞭毛，無芽胞，無莢膜。8.3革蘭氏染色按GB4789.28-2013中的方法進行革蘭氏染色反應。若革蘭氏染色呈陰性，則進行下一步檢測。8.416SrRNA測序鑒定從分離的菌株中提取DNA作為模板，PCR擴增青枯菌16SrRNA基因片段，以無菌雙蒸水模板做為空白對照，用已知青枯菌菌株DNA做陽性對照，擴增目的片段大小約為280bp。PCR產(chǎn)物回收后測序、比對，具體檢測方法步驟按附錄B中的B.4規(guī)定執(zhí)行。8.5LAMP快速檢測7DB44/TXXXXX—XXXX（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和B3（5-ACCGCAACACGGGATCA-3）為外側引物，F(xiàn)IP（5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3）和BIP（5-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）為內側引物。LAMP反應結束后對擴增產(chǎn)物進行檢測，具體檢測方法步驟按附錄B中的B.5規(guī)定執(zhí)行。8.6致病性測定8.6.1褐梗小枝水培接種材料選擇對青枯病抗性具有差異的木麻黃無性系，如A13與K18（感?。?，G1與30（抗?。┑?。方法恒溫水培接種法，具體操作方法按附錄B中的B.6規(guī)定執(zhí)行。相對病害強度分級標準相對病害強度分級標準如下：a)0級：分枝無癥狀，級數(shù)值為0；b)1級：分枝萎蔫下垂，保持綠色，級數(shù)值為1；c)2級：分枝枯黃、萎蔫下垂，級數(shù)值為2；d)3級：分枝干枯死亡，級數(shù)值為3。病情指數(shù)病情指數(shù)是全面考慮發(fā)病率與嚴重度的綜合指標。病情指數(shù)按式（1）計算?！?）式中：ID——病情指數(shù)；Ni——各級病級分枝數(shù)；Gi——各級病級相應級數(shù)值；Gk——最高級數(shù)值；Nt——調查總分枝數(shù)。8.6.2小苗盆栽接種材料選擇對青枯病抗性具有差異的木麻黃無性系，如A13與K18（感?。?，G1與30（抗?。┑?。方法移栽浸根接種法，具體操作方法按附錄B中的B.7規(guī)定執(zhí)行。8DB44/TXXXXX—XXXX死亡率計算以株為單位調查，記錄無病植株與死亡植株數(shù)。死亡率按式（2）計算。%……（2）式中：P——死亡率；D——死亡植株數(shù)，單位為株；N——調查總株數(shù)，單位為株。9菌株鑒定分離純化得到的細菌菌株符合以下幾方面的檢測結果，則可以判定為青枯菌菌株。a）在TTC半選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征與描述相符。b）革蘭氏染色反應呈陰性。c）PCR擴增產(chǎn)物測序結果與已知的Ralstoniasolanacearum16SrRNA基因序列同源性達99%以上或經(jīng)LAMP快速檢測，反應結束后反應管中反應液呈現(xiàn)綠色。10強致病性菌株篩選符合以下兩個方面的檢測結果，則可以判定為青枯菌強致病性菌株。a）褐梗小枝水培接種法，參試植物材料的病情指數(shù)均在70以上。b）小苗盆栽接種參試植物材料死亡率均在70%以上。11菌種保存11.1蒸餾水保存法將分離純化后的病原菌放入盛有滅菌蒸餾水的試管中，控制菌的濃度約107–8cfu/ml，加塞放入4℃恒溫冰箱中臨時保存，保存時間不超過1周。11.2甘油液保存法將純甘油配制成50%的水溶液，高壓滅菌后置于-20℃冰箱待用。保存菌種時將50%甘油與菌液按2:1比例混合，劇烈震蕩，充分混勻，置-20℃至-80℃可保存3年左右。11.3液氮超低溫保存法將冰浴過的青枯菌菌懸液分裝到冷凍管內，套上熱收縮塑料管，加熱，并使之完全密封。將密封好的冷凍管快速在液氮中冷凍，再將冷凍過的冷凍管放入液氮罐的格子內保存，經(jīng)常注意補充液氮，可保存10年以上。11.4冷凍干燥保存法9DB44/TXXXXX—XXXX在培養(yǎng)皿中分離純化好菌種后，加入高壓滅菌過的保護劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起，制成菌懸液。將菌懸液分裝于安瓿管中，在-80℃冰箱預凍1h～2h，再將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機內開始冷凍干燥8h～20h，可保存10年以上。DB44/TXXXXX—XXXX（資料性）木麻黃青枯菌A.1地理分布亞洲、歐洲、非洲、北美洲、南美洲均有分布；我國主要分布于福建、廣東、廣西、海南、浙江、江蘇、湖北、湖南、江西、云南、貴州、四川、重慶、山東、河南、河北、安徽、北京、天津、上海、臺灣。A.2寄主范圍該病菌可侵染茄科、豆科、芭蕉科等54個科的450余種植物，主要有：木麻黃、桉樹、番茄、馬鈴薯、茄子、煙草、香蕉、海里康、桑樹、龍葵、辣椒、花生、芝麻、甘薯、油橄欖和姜等。A.3病株癥狀植株感染青枯菌后，小枝黃化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多，根系發(fā)黑腐爛，木質部局部或全部變褐色至黑褐色，樹皮?？v裂成潰瘍狀，壞死根莖有水浸臭味，根、主莖、側枝橫切面?zhèn)谟腥榘咨咙S褐色的細菌膿液溢出。A.4病原菌形態(tài)特征生物學特性病菌呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（1.5μm～2.5μm）×（0.5μm～0.7μm），多數(shù)無鞭毛，少數(shù)具1根～3根極生鞭毛，無芽胞，無莢膜，革蘭氏陰性菌。病菌從植物根系或受傷部位侵入木質部的維管束，并在維管束中大量繁殖并迅速擴散至整個植株，產(chǎn)生大量胞外多糖、細胞壁降解酶等物質，堵塞維管束中的液流運輸，破壞導管組織，從而引起植物萎蔫死亡。A.5木麻黃青枯病病害流行規(guī)律通常發(fā)生在臺風暴雨后，造成大量樹木死亡；積水等低洼地容易導致病害發(fā)生；高溫干旱季節(jié)是病害的高發(fā)期。DB44/TXXXXX—XXXX（規(guī)范性）培養(yǎng)基及試驗方法B.1CPG（Casaminoacid-Peptone-Glucose）培養(yǎng)基蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，瓊脂17g（配制液體培養(yǎng)基時不加入瓊脂），調節(jié)PH至7.0，121℃濕熱滅菌20min。B.2TTC選擇性培養(yǎng)基蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，瓊脂17g，調節(jié)PH至7.0，121℃濕熱滅菌20min后，溫度降至50℃左右，用過濾滅菌方法加入2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）0.05mg/L。B.3革蘭氏染色法B.3.1結晶紫染色液結晶紫1.0g，95%乙醇20.0ml，1%草酸銨水溶液80.0ml，將結晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。B.3.2革蘭氏碘液碘1.0g，碘化鉀2.0g，蒸餾水300.0ml，將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300ml。B.3.3沙黃復染液沙黃0.25g，95%乙醇10.0ml，蒸餾水90.0ml，將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。B.3.4染色法染色步驟如下：1）將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗；2）滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗，用吸水紙吸去水分；3）滴加95%乙醇脫色，約30s；或將乙醇滴滿整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s。水洗，吸去水分；4）沙黃復染液染1min，自來水沖洗；干燥，鏡檢；5）被染成紫色的細菌稱為革蘭氏陽性菌（G+菌），染成紅色的稱為革蘭氏陰性菌（G－菌）。B.4PCR檢測方法B.4.1細菌DNA模板的制備無菌操作下，將純化后的待測菌制成菌懸液，或取可疑植物組織，按照細菌基因組DNA抽提試劑盒方法提取基因組DNA，測定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。DB44/TXXXXX—XXXXB.4.2引物OLI1：5-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3Y2：5-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3B.4.3PCR反應體系體系為25μL：1×PCR緩沖液（20mMTris-HCl，pH8.4，20mMKCl，10mM(NH4)2SO4，1.5mMMgCl2）0.2mM，dNTP0.2mM，引物各1μM，Taq酶1U，模版2μL，加ddH2O至25μL。B.4.4PCR反應條件變性：96℃,2min。三溫循環(huán)：94℃,20s；68℃,20s；72℃,30s。50個循環(huán)后，72℃延伸10min。B.4.5PCR結果判定2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，如能觀察到280bp左右的PCR產(chǎn)物條帶，則可判定為可疑木麻黃細菌性青枯病菌，進一步測序鑒定，否則為陰性。B.4.6測序將PCR產(chǎn)物回收后，進行克隆、測序，或者直接測序（測序可由生物公司完成測序引物為OLI1、Y2。B.4.7比對測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有青枯菌（R.solanacearum）菌株的16SrRNA基因序列進行比對，同源性99%以上時將該病原菌鑒定為青枯菌。B.5LAMP快速檢測鑒定B.5.1細菌DNA模板的制備按附件B中的B.4.1規(guī)定執(zhí)行。B.5.2引物設計和合成以青枯菌的lpxC作為檢測靶標，利用PrimerExplorerVersion4.0（http://primerexplorer.jp/e/）在線設計4條LAMP特異性引物，其中F3（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和B3（5-ACCGCAACACGGGATCA-3）為外側引物，F(xiàn)IP（5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3）和BIP（5-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）為內側引物。B.5.3LAMP反應體系LAMP反應體系設定為25μL：體系中內引物FIP和BIP的濃度分別為1.6μmol·L-1，外引物F3和B3的濃度分別為0.2μmol·L-1，dNTPDB44/TXXXXX—XXXXTris-HCl，10mmol·L-1(NH4)2SO4，50mmol·L-1KCl，6mmol·L-1MgSO4，0.1%Tween-20），模板DNA1μL，然后加入8個單位的Bst2.0DNA聚合酶，補水至25μL?；靹螂x心后，63℃孵育45min。B.5.4擴增產(chǎn)物檢測反應前在PCR管內蓋上加入1μLSYBRGreenⅠ熒光染料，反應結束后瞬時離心，將染料與反應液混勻后觀察顏色變化，若反應管中有青枯菌DNA的大量擴增，則反應管顏色呈現(xiàn)綠色，反之為橙色。B.6恒溫水培接種法B.6.1試驗設計無性系與菌株的雙因素交叉試驗。每個無性系與每個菌株的一次試驗為一個處理。B.6.2植物材料15cm～20cm木麻黃褐梗小枝，每個褐梗小枝含有8個～10個分枝。每個處理需要3段～4段褐梗小枝（共包含約30個分枝）。B.6.3菌株經(jīng)分離純化、鑒定后的青枯菌菌株作為測定菌株。B.6.4操作方法各處