飼料中維生素D3的測定 高效液相色譜法 編制說明

2飼料中維生素D3的測定高效液相色譜法編制說明一、工作簡況，包括任務(wù)來源、制定背景、工作過程等根據(jù)《國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會關(guān)于下達(dá)2020年第三批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所、帝斯曼維生素（上海）有限公司、四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司、中牧實(shí)業(yè)股份有限公司、廣州愛保農(nóng)生物科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAC/TC76）提出并歸口。），存在于魚肝油和脂肪組織中，主要用于防止動物佝僂病，改進(jìn)骨骼中鈣與磷的但隨著近年檢測技術(shù)的發(fā)展，特別是固相萃取技術(shù)的普及、其與高效液相色譜的結(jié)合（在線固相萃取的應(yīng)用）、柱切換二維液相色譜發(fā)展、以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜應(yīng)用，為提高維生素D3檢測方法總體性能、提高準(zhǔn)接到修訂任務(wù)后，成立了趙小陽、宋榮、虞哲高、張鳳枰、朱高群、劉志英、郭紅雙、馬曉忠、汪忠艷、李俊玲、謝麗、宋艷、杜斌、張輝、李麗蓓、草單位，科研院所技術(shù)人員召開標(biāo)準(zhǔn)修訂啟動會，會上詳細(xì)研討修訂路線，明3確各起草單位工作分工，中牧實(shí)業(yè)股份有限公司、廣州愛保農(nóng)生物科技有限公司承擔(dān)維生素預(yù)混合飼料添加回收率樣品的制備及直接提取方法的驗(yàn)證，安捷倫科技公司介紹了本單位工作基礎(chǔ)及科研進(jìn)展，四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司查閱整理了國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，并承擔(dān)定向征求意見匯總；在廣泛調(diào)查研究、）；）；）；）；f)增加固相萃取法、在線固相萃取法（見）；）；）；j)增加了液相色譜參考條件（見和）；2023年6月，河南省獸藥飼料監(jiān)察所、北京市飼料獸藥監(jiān)察所、遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心、上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司、鈦和中譜所提意見的意見匯總表。標(biāo)準(zhǔn)起草組進(jìn)一步修改了標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明，形成4二．標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及其確定依據(jù)序號標(biāo)準(zhǔn)號標(biāo)準(zhǔn)名稱1ISO14892:2002Driedskimmedmilk—DeterminationofvitaminDcontentusinghigh-performanceliquidchromatography2AOACofficicalMethod995.05VitaminDInfantForrmulasandEnteralProductsLiquidChromatographicMethodFirstAction19953GB5009.82-2016食品中維生素A、D、E的測定4GB5009.296.2023食品中維生素D的測定法。有的方法在皂化后用液液萃取或/和固相），酸乙酯+正己烷（GB5009.296-2023第二后，又增加正相硅膠柱半制備液相色譜的凈化。5005 原標(biāo)準(zhǔn)中直接提取法只適用于明膠包被的維生素D3，針對目前市場上開始使用的淀粉包被的維生素D3，需用水先超聲溶解將淀粉包被打開，再用甲6三、試驗(yàn)驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果飼料堿溶液皂化試樣后，經(jīng)固相萃取柱富集、分離、凈化、濃縮后，殘?jiān)苡谶m當(dāng)溶劑，注入HPLC分離，在波長264nm條件下測定，外標(biāo)法計(jì)算維生素同時(shí)需要去除皂化液中的強(qiáng)堿以保護(hù)分析色譜柱，因此固相萃取柱均選擇商品烷酮聚合物填料的類型，親水基團(tuán)鍵合在填料內(nèi)部，疏水性物質(zhì)的保留能力就弱了。實(shí)驗(yàn)中比較了安捷倫BondElutHL），腈洗脫。綜合考慮維生素A、D3、E的回收率結(jié)果，A7品，混合均勻后過柱，堿性皂化液上樣后，需要采用足量的淋洗溶劑對堿液進(jìn)），證三種維生素的回收率，考慮到高水相對堿液的良好淋洗去除效果，綜合不同淋洗溶劑對于共萃取基質(zhì)干擾物的去除，最終選擇8mL10%的甲醇溶液作為取6mL均勻分散的皂化液，分別加入等量VD3標(biāo)準(zhǔn)樣品，混合均勻后過柱，8mL10%甲醇溶液充分淋洗后，抽干小柱，選擇甲醇，乙腈，乙酸），9件中規(guī)定的固相萃取方法，稱取10g飼料樣品，定5.維生素D3不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與峰面積響應(yīng)維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（IU/mL）保留時(shí)間（min）峰面積0.0152050用已知本底含量的豬配合飼料、產(chǎn)蛋雞復(fù)合預(yù)混合飼料、豬濃縮飼料、牛樣品類型添加濃度(IU/kg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)123456配合飼料460098.46103.8582.3196.1596.1588.4694.238.13920086.5488.4686.9290.3887.3186.9287.764600088.8588.08100.38105.77104.23104.2398.598.16復(fù)合預(yù)混料（產(chǎn)蛋雞）13200084.8587.8887.8896.9796.9793.9491.415.7126400098.4898.4893.9490.9189.3989.3993.434.55132000094.2494.8595.4599.7099.7099.3997.222.71濃縮飼料8300104.35108.70108.70104.35108.703.581660097.8397.83106.5295.6597.8397.8398.913.878300090.4391.7494.35100.43100.43101.3096.455.04精料補(bǔ)充料108.70104.35104.355.41100.006.0893.2693.2684.2993.26102.2384.2991.777.36配合飼料500103.34103.34103.3498.3996.7798.3998.95000101.72101.38102.41102.41101.72101.380.464.重復(fù)性豬配合飼料產(chǎn)蛋雞配合飼料犢牛精料補(bǔ)充料奶牛精料補(bǔ)充料豬濃縮飼料產(chǎn)蛋雞復(fù)合預(yù)混飼料123456平均含量（IU/kg）標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）5.方法再現(xiàn)性按照文件中規(guī)定的方法，在河南省獸藥飼料監(jiān)察所、北京市飼料獸藥監(jiān)察所、遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心方法驗(yàn)證符合要求，表明四個(gè)實(shí)通閥。在線的固相萃取小柱及分析色譜柱前各需要一個(gè)在線過濾器。在線固相乙醇稀釋，配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.16IU/mL、0.40IU/mL、0.80IU/mL、1.6表6精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）VD3的測定值（IU/kg）平均值（IU/kg）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）29122737243227962820302027855.加標(biāo)回收率試驗(yàn)用作精密度試驗(yàn)的飼料樣品也用于加標(biāo)回收率試驗(yàn)。將精密度試驗(yàn)測試的添加水平添加回收率（%）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）添加值196.845.5(n=3)197.176.8(n=3)296.505.2(n=3)選用豬復(fù)合預(yù)混合飼料、寵物飼料、雞配合飼料做添加回收率試驗(yàn)，回收樣品類型本底值（IU/kg)實(shí)測值（IU/kg)加標(biāo)量（IU/mL)加標(biāo)回收率（IU/kg)豬復(fù)合預(yù)混合飼料5680017120095.37720025360020088.29560021640012080023160092.316400039920024098.0寵物飼料（貓）5920103204.0640089603.280.07560145608.087.58840130004.09080124804.085.0禽類配合飼料248095608.088.53560106008.088.040808.096.544808.088.06.不同分析方法測定結(jié)果的比較1212有淀粉、麥芽糊精、玉米油包被等，原國標(biāo)檢測方法用甲醇在65℃時(shí)超聲提取可以覆蓋所有不同工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，將方法改為先用10mL水超聲提取，再用5000040000300002000010000050000400003000020000100000數(shù)據(jù)文件名:2.lcduAUVDVD5.0min105.0min照文件中規(guī)定的方法檢測，檢測結(jié)果見表10，兩種方法回收率差值范圍為加水檢測（加水10mL65℃超聲5分鐘,再加甲醇超聲廠家廠家TXTXTHTHXFXFXHC103.22XHCHS95.7HS2.方法回收率與精密度按照維生素預(yù)混合飼料中維生素D3實(shí)際含量，制備含量分別為700萬稱樣量(g)峰面積檢測值（萬IU/kg）平均值（萬IU/kg）占標(biāo)識量（%）標(biāo)準(zhǔn)差RSD（%）豬用多維（2010CHT)1.0918103607682.8097.54701.87100.2735.185.011.078297177648.5092.641.009299646710.44101.491.0716109442734.85104.981.0748111014743.19106.171.015297560691.4698.78畜禽通用多維1.0902151222998.0692.411101.75102.0165.505.951.07421681801126.52104.311.06881585551067.4198.831.0831788911188.52110.051.06321681081137.68105.341.03521571541092.32101.14蛋雞多維1.07722673611785.8789.291895.3094.7773.793.890.99042609411895.7494.791.05582805691912.0895.601.06142965632010.41100.521.05282795901910.8495.541.07382771121856.8692.84V本文件樣品前處理補(bǔ)充固相萃取方法、在線萃取方法，第一法給出了三個(gè)色譜條件，對于用液液萃取法的，可選用色譜參考條件一，該色譜參考條件與配合飼料、精料補(bǔ)充料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料選用液液萃取法或固相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.46~8.16%；同一批次樣品重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于在線固相萃取方法的樣品前處理最簡單，只需做樣品皂化這一步，其余的都由儀器完成，具有操作簡便，儀器自動化程度高的特點(diǎn)。對于堿性溶液的洗脫，目標(biāo)分析物轉(zhuǎn)移至分析色譜柱，均是通過在線固相萃取系統(tǒng)完成的，在分析方法的開發(fā)上，在線固相萃取系統(tǒng)的條件需與色譜分離系統(tǒng)的條件相匹配，因此增加了色譜參考條件三。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明濃度在0.16~16IU/mL范圍直接提取法樣品前處理改為先用水超聲提取，對于明膠與淀粉混合包被及淀粉包被的產(chǎn)品，提取效果好，再用甲醇超聲提取，色譜條件同原標(biāo)準(zhǔn)方法中法和修訂的方法檢測含量，回收率分別是95.7%和109.8%，測定結(jié)果表明方法四、與國際、國外同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對比情況，或者與測試的國外樣品、樣機(jī)的有關(guān)數(shù)據(jù)對比情況國際標(biāo)準(zhǔn)、AO