復(fù)元膠囊誘導(dǎo)氣虛血瘀證大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究

復(fù)元膠囊誘導(dǎo)氣虛血瘀證大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究

世界上每年有900萬(wàn)人死亡，占所有死亡原因的1.3%。中醫(yī)早就認(rèn)識(shí)到,心腦血管病“其來(lái)也漸,其發(fā)也驟,其死也速,其愈也緩”,其病機(jī)主要是氣虛血瘀,治療應(yīng)以益氣活血為主。這些認(rèn)識(shí)見(jiàn)于對(duì)“心痛”、“胸痹”、“痰飲”、“中風(fēng)”等疾病的論述。現(xiàn)代研究認(rèn)為,氣虛血瘀是心血管疾病的病機(jī)關(guān)鍵。近來(lái)有研究報(bào)道,在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)所引起的心血管疾病可見(jiàn)血管壁中膜層的平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移及過(guò)度增殖。血管平滑肌細(xì)胞凋亡不足是AS早期發(fā)生的重要因素。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的主動(dòng)性死亡,bcl-2和bax是與細(xì)胞凋亡關(guān)系較為密切的兩種基因。bcl-2和bax比值是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵。近來(lái)有研究報(bào)道,中醫(yī)用益氣活血法防治AS取得可喜成就,其機(jī)制與調(diào)節(jié)血脂代謝,改善血液流變性,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能等方面有關(guān),但從影響血管平滑肌細(xì)胞凋亡的角度研究甚少,。復(fù)元膠囊由黃芪、淫羊藿、川芎、當(dāng)歸、枸杞等組成,具有益氣補(bǔ)腎活血之功效。通過(guò)以往研究證實(shí),復(fù)元膠囊通過(guò)益氣、活血治療能明顯改善氣虛血瘀證患者的血液流變學(xué)、心腦血流動(dòng)力學(xué)及血管活性物質(zhì)的失衡狀態(tài)。本研究旨在原有研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討復(fù)元膠囊對(duì)氣虛血瘀血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響,從細(xì)胞凋亡分子生物學(xué)、基因表達(dá)等角度研究復(fù)元膠囊作用于氣虛血瘀證的可能機(jī)制,為更深入的臨床研究提供依據(jù),并為中醫(yī)藥在治療氣虛血瘀證的實(shí)驗(yàn)研究方面作出有益的探討。材料和方法1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物合格號(hào)SD大鼠40只,雌雄各半,月齡16月,體重600～800g,重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(渝)2007-0001。復(fù)元膠囊,重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn),為道地藥材(經(jīng)過(guò)專(zhuān)家鑒定和指紋圖譜分析),生產(chǎn)批號(hào):070625,每粒含量0.40g。1.2標(biāo)記檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)┒嗣撗鹾塑账徂D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自Boehringermannheim公司。bcl-2,bax蛋白多克隆抗體購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。2大鼠的一般情況將大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(n=10),模型組(n=15),復(fù)元膠囊組(n=15)。模型組、復(fù)元膠囊組按王鍵等制作氣虛血瘀證大鼠模型方法造模:①饑餓。大鼠按40g·kg-1·d-1提供飼料,每日8∶00給予全天量的2/3,20∶00給予剩余1/3飼料。②疲勞。大鼠每日14∶00開(kāi)始分批置入直徑50cm,高100cm的水桶內(nèi),桶內(nèi)水深約45cm,水溫與室溫均保持為(10±0.5)℃。以木棒撥打強(qiáng)迫其不斷游泳直到疲勞,時(shí)間長(zhǎng)短存在個(gè)體差異,平均為(10±5)min。③寒濕。游泳后撈出大鼠,不予保溫措施及擦拭水跡,關(guān)閉門(mén)窗任其暴露于空氣中自然晾干。④驚慌憂恐。將未游泳大鼠放置水桶旁,任其傾聽(tīng)正在游泳大鼠掙扎叫聲。⑤高脂飲食。將特制脂肪乳按5mL·kg-1加人大鼠日常飲水中,脂肪乳配方每500mL由豬油20g,膽固醇10g,膽鹽2g,聚山梨酯-8020mL,1,2-丙二醇20mL,用適量蒸餾水配制而成。造模時(shí)間為4周。復(fù)元膠囊組大鼠給予復(fù)元膠囊1g·kg-1(復(fù)元膠囊溶于生理氯化鈉溶液);模型組和正常對(duì)照組給予等容量生理氯化鈉溶液,qd,每次灌胃容量為13.3mL·kg-1,喂養(yǎng)1個(gè)月。3觀測(cè)指標(biāo)3.1免疫組化檢測(cè)將各組大鼠麻醉后取一側(cè)股動(dòng)脈血管平滑肌,迅速固定于4%多聚甲醛中,制成石蠟切片,以做凋亡及免疫組化檢測(cè)。取另一側(cè)股動(dòng)脈血管平滑肌,迅速固定于10%戊二醛中,置于4℃冰箱保存,備電鏡檢測(cè)各組平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異。3.2對(duì)赫染色的形態(tài)觀察將石蠟切片脫蠟后切片蘇木素一伊紅(HE)染色,光鏡下觀察血管內(nèi)膜、中膜情況。3.3eli等陽(yáng)性細(xì)胞TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,按Gavrieli等所述方法進(jìn)行。陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核出現(xiàn)褐色,即凋亡細(xì)胞。計(jì)算凋亡指數(shù)(SMAI):SMAI/%=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100。3.4微生物樣本的檢測(cè)股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞bcl-2,bax的表達(dá)采用鏈酶抗生物蛋白-過(guò)氧化物酶(SP)染色法,微波修復(fù)抗原,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,同時(shí)作不加一抗而其他條件均相同的陰性對(duì)照。胞漿染有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞面積占整體面積的百分?jǐn)?shù)。3.5半干活性重質(zhì)碳酸鈣片的制備標(biāo)本用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗,1%鋨酸鈾固定后梯度脫水,環(huán)氧樹(shù)脂618包埋,制作超薄切片,用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,HU-12A型電鏡觀察攝片。4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用xˉ±sxˉ±s表示,采用one-wayANOVA,并進(jìn)行兩兩比較,以P<0.05為差異有顯著性。結(jié)果1各組大鼠虛假證辨證量表、復(fù)元膠囊對(duì)大鼠市場(chǎng)的影響模型組大鼠不同程度地出現(xiàn)倦怠嗜睡,精神萎頓,毛發(fā)稀疏易脫落等氣虛癥狀,以及舌質(zhì)較絳紫暗淡、尾部自尖至根出現(xiàn)皮下瘀紫或青斑等血瘀癥狀。根據(jù)大鼠氣虛血瘀證辨證量表,模型組大鼠均得分在50分以上。復(fù)元膠囊組、正常對(duì)照組大鼠幾乎沒(méi)有出現(xiàn)以上癥狀。根據(jù)大鼠氣虛血瘀證辨證量表,復(fù)元膠囊組、正常對(duì)照組大鼠均得分在10分以下。同時(shí),對(duì)各組大鼠進(jìn)行血液流變學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,模型組全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞電泳時(shí)間均顯著升高(P<0.01);復(fù)元膠囊組無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。2復(fù)元膠囊組、正常組中膜的增長(zhǎng)模型組中膜平滑肌顯著增厚,肌纖維粗大,層數(shù)增多,排列致密;復(fù)元膠囊組、正常對(duì)照組中膜平滑肌走行清晰,無(wú)增生;彈力纖維未見(jiàn)異常。均無(wú)明顯增厚現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)圖1。3復(fù)元膠囊對(duì)bcl-2表達(dá)的影響胞漿染有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。模型組的VSMCs中bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01),用復(fù)元膠囊治療后,bcl-2陽(yáng)性率較模型組明顯降低(P<0.05),提示復(fù)元膠囊抑制bcl-2蛋白表達(dá);各組VSMCs中bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)明顯差別,然而復(fù)元膠囊組表達(dá)稍高。bcl-2/bax比值模型組較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.01),復(fù)元膠囊組較模型組明顯降低(P<0.01),與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2,圖2,圖3。4各組大鼠血管平滑凋亡情況比較陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核出現(xiàn)褐色,即凋亡細(xì)胞。模型組較正常對(duì)照組SMAI明顯減少(P<0.01),模型組大鼠血管平滑肌凋亡嚴(yán)重受阻。復(fù)元膠囊組與模型組、正常對(duì)照組比較,SMAI明顯增加(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。5小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞增殖和復(fù)元膠囊組正常對(duì)照組主要為正常血管平滑肌細(xì)胞;模型組可見(jiàn)代表有細(xì)胞增殖的幼稚血管平滑肌細(xì)胞;復(fù)元膠囊組可見(jiàn)有線粒體腫脹,染色質(zhì)邊集以及核固縮等形態(tài)學(xué)改變征象。電鏡下各組血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖5。復(fù)元膠囊對(duì)大鼠血清中bax、放空率的影響現(xiàn)代研究認(rèn)為,氣虛血瘀傾向是現(xiàn)代人群一個(gè)突出的體質(zhì)病理學(xué)特征;從以藥測(cè)證的角度推論,冠心病的病機(jī)關(guān)鍵是氣虛血瘀,因?yàn)閼?yīng)用益氣活血中藥治療動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病取得良好的臨床效果;同時(shí)氣虛血瘀證的病理變化主要表現(xiàn)在內(nèi)皮功能障礙,這同時(shí)也是AS的啟動(dòng)步驟。因此我們推斷,氣虛血瘀是心血管疾病的病機(jī)關(guān)鍵。近來(lái)有研究報(bào)道,活血化瘀治療冠心病的作用機(jī)制不僅限于傳統(tǒng)意義上的活血通脈,它不僅具有調(diào)整脂質(zhì)代謝失調(diào)、抗氧自由基損傷,減輕缺血再灌注損傷、抗凝作用,而且還具備保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用。在動(dòng)脈粥樣硬化所引起的心血管疾病可見(jiàn)血管壁中膜層的平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移及過(guò)度增殖。AS早期,VSMC的增殖與凋亡失衡造成了VSMC數(shù)量的過(guò)度增加,因而,調(diào)整平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的平衡,維持血管壁細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定在正常水平是治療AS的重要途徑。bcl-2原癌基因產(chǎn)物主要存在于線粒體膜和核膜的蛋白質(zhì),抑制細(xì)胞凋亡。而與其相對(duì)的基因bax則抑制細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)凋亡。它們需構(gòu)成二聚體結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮作用。bcl-2同源二聚體及bax異源二聚體參與抑制細(xì)胞凋亡調(diào)控,只有bax同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡,因此bcl-2/bax比值是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用饑餓、寒冷、驚恐、高脂飲食等方法制作氣虛血瘀證大鼠模型。造模方法人工模擬了以下可導(dǎo)致氣虛的因素:①“人過(guò)四十,陰氣自半”。中年以后肺脾腎等五臟漸衰,故選擇老年大鼠使之本身具有氣虛衰弱之體質(zhì)。據(jù)載,大鼠月齡16個(gè)月相當(dāng)于人類(lèi)45～60歲,與臨床氣虛血瘀證高發(fā)年齡段一致。②“饑則損氣”。長(zhǎng)期慢性饑餓可導(dǎo)致以脾胃氣虛為主的全身性氣虛表現(xiàn)。③“勞則耗氣”。強(qiáng)迫大鼠游泳,使之產(chǎn)生疲勞可耗氣傷精,勞累之后更加納呆食差。④“濕傷脾,寒傷腎”。游泳水溫及室溫均低于大鼠體溫,且泳后不予保溫措施和擦拭水跡,則通過(guò)寒、濕兩種致病因素導(dǎo)致脾、腎二臟損傷。⑤“憂思傷脾,驚恐傷腎”。任大鼠傾聽(tīng)同類(lèi)在水桶中游泳掙扎聲響,使其產(chǎn)生憂慮與驚恐的情緒,表現(xiàn)為全身顫抖,四肢蜷縮或躁煩亂竄,具有七情內(nèi)傷作用。⑥“肥甘厚味易致高粱之疾”。在以上基礎(chǔ)上給予大鼠飲用脂肪乳,有助于形成心、腦血管病的高危因素如高脂血癥,動(dòng)脈粥樣硬化,血液稠黏,內(nèi)皮功能障礙等。中醫(yī)理論認(rèn)為肥甘厚味滋膩礙胃而傷脾,又可助生痰濕導(dǎo)致瘀血證的發(fā)生,故具有促進(jìn)氣虛與血瘀的雙重作用。另寒濕等致病因素有利于血瘀證的形成。并與氣虛血瘀夾雜,形成氣虛、血瘀、寒凝的證侯。在本實(shí)驗(yàn)中,模型組與正常對(duì)照組相比較,HE染色可見(jiàn)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)膜及中膜平滑肌顯著增厚,肌纖維粗大,層數(shù)增多,排列致密。SMAI減少,bcl-2蛋白表達(dá)、bcl-2/bax增加,顯示模型組的VSMC增殖和凋亡嚴(yán)重失調(diào),而復(fù)元膠囊組與模型組相比,中膜平滑肌走行清晰,無(wú)增生;彈力纖維未見(jiàn)異常,無(wú)明顯增厚現(xiàn)象。SMAI增加,bcl-2表達(dá)減少、bcl-2/bax下降,提示復(fù)元膠囊能改善氣虛血瘀證VSMC的這種平衡失調(diào),改變了bcl-2/bax表達(dá)比率,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的增加。本研究中發(fā)現(xiàn)雖然復(fù)元膠囊組大鼠bax上調(diào)不明顯,但bcl