電針和扶他林乳劑對骨關節(jié)炎軟骨中炎性細胞因子的影響

電針和扶他林乳劑對骨關節(jié)炎軟骨中炎性細胞因子的影響

骨關節(jié)炎（oa）是最常見的慢性病之一，通常導致關節(jié)疼痛和功能喪失。OA按病理特征分早、中、晚3期,目前尚無特效療法,治療目標主要是止痛和改善關節(jié)功能。對于早中期患者以保守治療為主,包括非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥、關節(jié)腔內注射激素或透明質酸鈉、物理療法、運動療法,以及中藥內服外敷、針灸、推拿等,晚期患者則適宜手術治療。OA屬中醫(yī)“痹癥”范疇,針灸治療痹癥歷史悠久,具有鎮(zhèn)痛、消腫、改善關節(jié)活動功能的作用。為揭示針灸治療OA的部分作用機制,本研究采用免疫組化技術,探討針刺對OA軟骨中白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的影響。1材料和方法1.1大鼠體質量變化由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供的清潔級雌性SD大鼠40只,6~7周齡,體質量(190±10)g。實驗動物質量合格證號:SCXK(京)2006-0008。動物實驗室:北京協(xié)和醫(yī)院動物實驗室。1.3正常組、模型組、針刺組實驗采用染色法對所有實驗大鼠進行編號,按隨機數字表隨機分配到正常組、模型組、針刺組、對照組,各10只。模型組、針刺組、對照組用單側后肢跟腱切除法建立OA動物模型:切除左后肢跟腱,術后自由活動、進食、攝水,4周后造模成功。1.4穴位常規(guī)消毒組1.4.1正常組無特殊處理。1.4.2模型組造模術后不予治療。1.4.3針刺組于造模術后第5周開始治療。取穴:非手術側(右后肢)膝前(定位:后肢膝蓋前方),后三里(定位:膝關節(jié)后外側,在腓骨小頭下約5mm處)。穴位常規(guī)消毒,選用Φ0.20mm×13mm無菌針灸針,得氣后接電療儀,用連續(xù)波刺激20min,頻率2Hz,強度以局部肌肉出現收縮為度。每日1次,5次為1個療程,療程間休息2d,治療2個療程。1.4.4對照組與針刺組同時開始治療。采用扶他林乳劑(雙氯芬酸二乙胺乳膠劑)治療,劑量為0.2g·kg-1·d-1,涂擦于每只大鼠非手術側(右后肢)膝關節(jié)處(采用剃毛法去除關節(jié)局部體毛),每日1次,5次為1個療程,療程間休息2d,治療2個療程。1.5觀測指標和方法1.5.1小鼠右小鼠膝關節(jié)骨折的收集于實驗第7周采用斷髓法處死全部大鼠,收集每只大鼠右后肢膝關節(jié)股骨端軟骨,用4%多聚甲醛固定,10%甲醛浸泡,15%乙二胺四乙酸浸泡,石蠟包埋。1.5.2過氧化物酶阻斷劑切片厚度4~5μm,暴露抗原,二甲苯脫蠟,梯度乙醇組織切片水化,抗原修復,過氧化物酶阻斷劑抑制內源性過氧化物酶。蛋白阻斷劑孵育,一抗孵育,一抗后封閉劑孵育,NovoLinkTM聚合物(二抗)孵育,DAB工作液顯色,蘇木素復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。1.6統(tǒng)計學分析IL-1β、TNF-α表達陽性細胞IOD值以x軃±s表示。統(tǒng)計學分析采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件,正常組與模型組比較采用成組設計定量資料t檢驗;模型組、針刺組和對照組3組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗。2結果2.1細胞排列改變正常組軟骨表面光滑,表層細胞呈梭形,近似水平排列,中間層細胞圓形,散在分布,柱狀層細胞排列呈柱狀。模型組關節(jié)軟骨變薄,軟骨細胞數目減少,細胞排列紊亂。針刺組軟骨層變薄,細胞排列紊亂。對照組軟骨變薄,軟骨細胞數目減少,細胞排列紊亂。2.2小鼠軟骨細胞il-1、tnf-表達的染色顆粒正常組軟骨細胞胞漿中偶見淺棕黃色IL-1β、TNF-α弱陽性染色。模型組見大量軟骨細胞呈深棕色IL-1β、TNF-α強陽性染色顆粒。針刺組和對照組軟骨細胞胞漿呈淺棕黃色IL-1β、TNF-α陽性染色。4組軟骨細胞免疫組化染色結果(×200)見圖1-8。2.3模型組il-1和tnf-的表達情況4組軟骨細胞IL-1β、TNF-α陽性表達的IOD值比較見表1。由表1可見,模型組IL-1β和TNF-α的表達都較正常組上調。模型組、針刺組和對照組比較,IL-1β和TNF-α的表達差異均有統(tǒng)計學意義,針刺組和對照組的表達均較模型組下調,兩者在針刺組與對照組的表達差異無統(tǒng)計學意義。3討論3.1小鼠膝關節(jié)外誘發(fā)性生動物模型臨床以膝骨關節(jié)炎最為常見,女性多于男性,并且鼠軟骨細胞凋亡方式與人類軟骨細胞凋亡相似,因此本研究選用雌性大鼠作為實驗動物。研究顯示,異常高應力是導致關節(jié)軟骨退變的重要因素。本實驗采用單側后肢跟腱切除法建立OA動物模型。該法屬OA的關節(jié)外誘發(fā)模型,只改變后肢負重而不影響肢體的活動,較切斷膝關節(jié)交叉韌帶、半月板、關節(jié)內注射藥物等關節(jié)內誘發(fā)模型更接近人類OA的形成過程,且方法簡單、創(chuàng)傷小、成功率高。一側后肢跟腱切除后,對側后肢負重代償性增加,膝關節(jié)應力異常增高。電鏡觀察造模術后1周軟骨表面光整,無凹陷無裂隙。術后2周軟骨表面出現凹陷和小裂隙,膠原纖絲裸露。術后4周,軟骨表面的許多部位出現裂隙,部分裂隙較寬大,縱橫交錯,屬OA中期病理改變。本研究中針刺組和對照組即是從造模4周后開始干預治療,組織學染色結果顯示造模大鼠膝關節(jié)軟骨明顯變薄,軟骨細胞數目明顯減少,細胞排列紊亂,符合OA中期病理改變。本實驗中無動物死亡發(fā)生。3.2tnf-影響因子目前發(fā)現與OA有關的細胞因子近10種,其中IL-1、TNF-α就是參與關節(jié)軟骨破壞的重要因子。IL-1分為IL-1α和IL-1β2種,生物活性相似,表現為刺激軟骨細胞和滑膜產生金屬蛋白酶等蛋白酶,促進軟骨基質的降解;刺激軟骨細胞和滑膜產生一氧化氮(NO),誘導關節(jié)軟骨細胞的凋亡;促進軟骨細胞和滑膜細胞產生前列腺素E2(PGE2)參與炎癥反應;促進成骨細胞樣細胞的增殖和骨吸收,參與骨質增生和軟骨下骨囊性變的形成;介導軟骨細胞分化,調節(jié)軟骨細胞表型變成成纖維細胞表型;抑制蛋白多糖的合成;抑制軟骨細胞的增殖。體外培養(yǎng)來源于OA的軟骨細胞能自發(fā)產生IL-1β。TNF分為TNF-α和TNF-β2種,兩者生物活性幾乎相同,具有強烈的破骨吸收活性。TNF-α與IL-1只有3%的同源性,生物活性比IL-1低100倍,兩者作用于不同的受體,但表現出許多相似的生物學特性。TNF-α可促進PGE的產生,而且可誘導軟骨細胞產生過氧化反應,與IL-1共同促進軟骨的吸收,從而介導骨性關節(jié)炎的軟骨破壞。本研究檢測到OA模型組中IL-1、TNF-α水平較正常組顯著升高,說明IL-1β和TNF-α隨著OA的發(fā)生而大量產生,引發(fā)一系列破壞性反應,進而促進軟骨的退變。3.3針刺治療的聯(lián)合用藥本實驗觀察到針刺組中軟骨細胞IL-1β、TNF-α的表達較OA模型組顯著下調,說明針刺對IL-1β、TNF-α的分泌具有明顯抑制作用。扶他林(雙氯芬酸鈉)是骨關節(jié)炎治療中經典的非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥,有口服和外用2種給藥途徑。針刺屬于中醫(yī)外治法,故本實驗選用扶他林乳劑關節(jié)局部涂擦作為對照組。本研究結果顯示針刺組IL-1β、TNF-α表達的下調與扶他林對照組無顯著差異,說明針刺對OA軟骨IL-1β、TNF-α的調節(jié)作用與扶他林乳劑相當。本實驗在造模4周后開始針刺治療,是通過在體動物實驗對OA中期病變治療效果的部分機制探討。本研究結果說明針刺具有抗炎作用,對受損關節(jié)軟骨具有一定的保護作用,其更多的作用機制有待進一步研究。1.2儀器、試劑和儀器扶他林乳劑(雙氯芬酸二乙胺乳膠劑,北京諾華制藥有限公司,批準文號:國藥準字H20020176)。漢醫(yī)牌Φ0.20mm×13mm無菌針灸針(天津華鴻醫(yī)材有限公司),長城牌KWD-808Ⅱ全能脈沖電療儀(常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司),RM2235型石蠟切片機(德國Leica公司),ZPJ-1A型展片機(天津天利航空機電有限公司),烤片機(北京百姓佳公司)。兔抗IL-1β(產品編號:bs-0812R),TNF-α(產品編號:bs-2081R),多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司提供)。NovoLinkTM聚合物檢測系統(tǒng)(珠海泉暉企業(yè)有限公司提供,產品編號:RE-7290),光學顯微鏡(NikonPHASECONTRAST0.90DRY),照相機(NikonEclipse80i)。1.5.3圖像分析方法先在10倍物鏡下確定股骨軟骨面內、外側髁頂點,換20倍物鏡,在內、外側髁頂點及附近區(qū)域各取2個清晰視野,共4個視野。顯微鏡物鏡固定為20倍,應用彩色圖像采集軟件NIS-Ele