黃連堿對l-名字致高血壓大鼠胸主動脈舒縮功能的影響

黃連堿對l-名字致高血壓大鼠胸主動脈舒縮功能的影響

中藥黃連是黃連科植物的干燥根莖。它是傳統(tǒng)醫(yī)學中使用的一種長期清熱解毒藥物，具有清熱、除濕、解毒、清火的功效?，F(xiàn)代研究表明,黃連具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病等作用。黃連中含有大量活性化合物,包括小檗堿、黃連堿、表小檗堿等多種異喹啉生物堿類化合物。有文獻報道,黃連堿可以通過將血管平滑肌細胞阻滯在G1期而發(fā)揮抗細胞增殖作用;但其對高血壓動物血管功能的研究尚未有報道。為了探討黃連堿對血壓以及血管功能的影響,本研究利用NO合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)誘導(dǎo)的大鼠高血壓模型,考察黃連堿對高血壓大鼠的降壓作用及其對L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠血管功能的影響。1材料和方法1.1化學試劑和儀器L-NAME、去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿(ACh)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、二丁酸佛波醇酯(PDBu)等購自美國Sigma公司;硝普鈉(SNP)購自北京化學試劑公司;黃連堿由中國醫(yī)學科學院藥物研究所秦海林老師課題組提供。BP-98A小動物無創(chuàng)尾壓測定儀購自日本Softron公司;BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司。其余試劑均為市售分析純。1.2實驗動物SPF級120～140gWistar♂鼠,購自北京維通利華實驗動物有限公司[合格證編號SCXK(京)2006-0009]。1.3動物分組及給藥方案取大鼠79只,隨機抽取15只作為正常對照組,其余作為高血壓模型組。模型組大鼠按每只每天40mg·kg-1灌胃L-NAME,正常組每天給予同等劑量蒸餾水。到L-NAME造模第3周時,測定大鼠尾動脈血壓,選擇SBP大于18.67kPa的動物(共54只)作為造模成功的高血壓大鼠進行后續(xù)研究。動物分組:除正常組外,模型動物隨機分為模型組(15只)、黃連堿低劑量組(12只)、黃連堿中劑量組(14只)、黃連堿高劑量組(13只)。黃連堿低、中、高劑量組大鼠每只每天分別灌胃給予黃連堿10、30、100mg·kg-1;連續(xù)給藥6周,期間每周測定一次給藥干預(yù)1h后的血壓和心率。此外,除正常對照組給予同等劑量的生理鹽水外,其余各組大鼠每只每天繼續(xù)給予40mg·kg-1的L-NAME。1.4kh液沖洗及血管張力檢測大鼠斷頭處死后,迅速分離胸主動脈并小心清除周圍脂肪及結(jié)締組織,剪取2段長約3mm的血管環(huán),懸掛于內(nèi)盛10mlK-H液(mmol·L-1:NaCl120,KCl4.7,KH2PO41.2,NaHCO325,glucose11.1,CaCl22.5,MgSO41.2)、37℃恒溫的浴槽中,充以95%O2和5%CO2的混合氣體。調(diào)節(jié)血管環(huán)的初始張力至1.2g,平衡1h,期間每隔20min用預(yù)溫至37℃的K-H液換液1次。隨后給予兩次80mmol·L-1KCl刺激,記錄KCl引起的最大收縮值。用K-H液沖洗至血管張力回到基線后進行下一步實驗。給予一段血管環(huán)累積濃度的NE(10-9～10-5mol·L-1,浴槽內(nèi)的終濃度,以下均同)刺激,觀察血管對NE的收縮反應(yīng)性。用KH液沖洗數(shù)次后,平衡20min,向浴槽中加入NE(10-6mol·L-1)使血管收縮達到平臺后再加入10-10～10-5mol·L-1的ACh,觀察血管依賴內(nèi)皮的舒張反應(yīng)。用KH液沖洗后,換成無鈣KH液平衡20min(中間每隔5min換一次新鮮無鈣KH液),加入NE(10-6mol·L-1),隨后再加入80mmol·L-1的KCl以及0.1～2.5mmol·L-1的CaCl2。給予另一段血管環(huán)累積濃度的KCl(10～80mmol·L-1)刺激,觀察血管對高鉀的收縮反應(yīng)性。用KH液沖洗至血管張力回到基線后加入AngⅡ(10-7mol·L-1);沖洗后平衡20min,加入NE(10-6mol·L-1)預(yù)收縮血管后再加入10-10～10-5mol·L-1的SNP,觀察不依賴內(nèi)皮的血管舒張反應(yīng)。用KH液沖洗兩次,平衡20min后再加入PKC激動劑PDBu(10-7mol·L-1)。1.5ach和snp的擴張反應(yīng),為ach、snp的表達提供了依據(jù)血管收縮反應(yīng)性以絕對張力值與高鉀(80mmol·L-1)刺激引發(fā)的最大收縮張力值的百分比表示;血管對ACh和SNP的舒張反應(yīng)以胸主動脈舒張張力值占10-6mol·L-1NE引起收縮張力值的百分比表示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用One-wayANOVA檢驗。2結(jié)果2.1對大鼠sbp、心率的影響給藥前,模型組與黃連堿低、中、高3個劑量組的SBP分別為(20.13±0.40)kPa、(20.80±0.53)kPa、(20.53±0.40)kPa、(20.53±0.40)kPa,均明顯高于正常組的(16.00±0.4)kPa,表明給予L-NAME3周的大鼠已形成高血壓狀態(tài),造模成功。給予黃連堿后,大鼠SBP并無下降趨勢,仍然繼續(xù)上升。此外,L-NAME造?？擅黠@降低大鼠的心率,同正常組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而黃連堿沒有逆轉(zhuǎn)L-NAME導(dǎo)致的心率降低,表明其對L-NAME導(dǎo)致高血壓大鼠的心率影響不大。結(jié)果見Fig1。2.2黃連堿對l-特羅大鼠胸動脈收縮功能的影響2.2.1比例比較由Fig2可知,模型組大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)鈣釋放引發(fā)的收縮反應(yīng)低于正常組大鼠(15.69±1.11)%vs(17.87±2.34)%;而黃連堿各劑量組的大鼠血管平滑肌對細胞內(nèi)鈣釋放引起的收縮反應(yīng)均比模型組增強,低、中、高3個劑量組的收縮值分別為(23.03±2.83)%、(22.22±2.11)%、(18.13±1.25)%,其中低、中劑量組同模型組比差異有顯著性(P<0.05)。2.2.2不同的血管對細胞外鈣內(nèi)流引起的收縮反應(yīng)的影響3為大鼠胸主動脈對細胞外鈣內(nèi)流引起的收縮反應(yīng)結(jié)果。由圖可知,與正常組相比,模型組大鼠的血管對細胞外鈣內(nèi)流引起的收縮反應(yīng)有降低的趨勢。低劑量的黃連堿能輕微升高外鈣內(nèi)流的收縮反應(yīng)性;而黃連堿中、高劑量組同模型組和正常組相比則表現(xiàn)出降低外鈣內(nèi)流引起的收縮反應(yīng)的趨勢,尤其是在鈣離子高濃度下黃連堿高劑量組同模型組比可降低這種反應(yīng)性(P<0.05)。2.2.3各組患者的收縮反應(yīng)比較L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠的胸主動脈對NE和KCl引起的收縮反應(yīng)同正常組比均有降低,尤其在NE高濃度下同正常組比較差異有顯著性(P<0.05)。但黃連堿3個劑量組大鼠的胸主動脈對NE和KCl的反應(yīng)性沒有改善的趨勢。2.2.4不同劑量化學成分對大鼠ang的反應(yīng)性影響模型組大鼠的胸主動脈對AngⅡ的反應(yīng)性與正常組相比有降低的趨勢(7.22±1.21)%vs(10.26±1.47)%。黃連堿各劑量組的胸主動脈對AngⅡ反應(yīng)性同模型組比有增加的趨勢,并呈一定的劑量依賴性。此外,L-NAME導(dǎo)致高血壓大鼠的胸主動脈對PDBu的反應(yīng)性同正常組比明顯增強(84.28±6.95)%vs(44.81±10.72)%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。黃連堿3個劑量組的血管對PDBu的收縮反應(yīng)性同模型組比均有降低的趨勢,但差異無顯著性。2.3不同劑量化nd-pcr對b深化了l-對no合酶的抑制作用長期給予L-NAME造模后,大鼠的胸主動脈對Ach的反應(yīng)性同正常組比明顯降低(P<0.05),說明L-NAME抑制了NO合酶,損傷了血管內(nèi)皮。黃連堿各個劑量組的胸主動脈對ACh的反應(yīng)性同模型組比沒有差異,表明黃連堿可能對內(nèi)皮依賴的血管舒張功能沒有改善作用。此外,各組別大鼠的血管對SNP的反應(yīng)性沒有差異。3對l-對大鼠的特殊影響血管內(nèi)皮來源的NO對維持機體血壓平衡具有重要作用。NO缺乏可導(dǎo)致一系列心血管疾病的發(fā)生,如高血壓、動脈粥樣硬化等。文獻報道,長期給予競爭性NO合酶抑制劑L-NAME可引發(fā)動物的持續(xù)性血壓升高,是一種理想的高血壓動物模型。這種模型的高血壓主要與血管產(chǎn)生的NO減少有關(guān)。本研究中,采用每天灌胃L-NAME40mg/kg/只,從第二周開始大鼠的血壓就持續(xù)升高,到第3周時大部分造模動物都出現(xiàn)高血壓狀態(tài)(SBP>140mmHg),表明該模型建立是可靠的。隨著造模時間的延長,模型組的血壓進一步升高。給予黃連堿6周后,大鼠的血壓沒有降低,同模型組比無差異,說明在本實驗中黃連堿可能對L-NAME誘導(dǎo)的高血壓沒有降壓作用。雖然黃連堿對L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠的血壓沒有影響,但黃連堿可明顯增強L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠血管平滑肌對細胞內(nèi)鈣釋放引起的收縮反應(yīng),并降低外鈣內(nèi)流引起的血管收縮能力,對血管功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。缺乏Ca2+的條件下給予α受體激動劑可通過肌醇三磷酸(IP3)通路刺激細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)中的鈣離子釋放,引發(fā)短暫的血管收縮。在無鈣KH液中,L-NAME長期給藥可以導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣釋放引起的血管收縮功能下降,但對細胞外鈣內(nèi)流引起的收縮反應(yīng)無影響,這與文獻報道一致。長期給予黃連堿后可明顯增加內(nèi)鈣釋放引發(fā)的血管收縮反應(yīng),提示黃連堿可能影響IP3-Ca2+通路。在無鈣環(huán)境中,黃連堿還能明顯降低血管對細胞外鈣內(nèi)流引起的收縮反應(yīng)性。本室前期研究發(fā)現(xiàn)黃連堿可抑制Rho激酶活性,而Rho激酶通路主要是通過Ca2+作用來引起血管收縮反應(yīng)。因而推測黃連堿可能通過抑制Ca2+內(nèi)流而降低血管的收縮反應(yīng)。有研究顯示,L-NAME誘導(dǎo)高血壓大鼠的胸主動脈的收縮功能受到損傷。本研究顯示,模型組大鼠的血管對NE引起的收縮反應(yīng)同正常組比顯著降低,對其它血管收縮因子如KCl、AngⅡ等引起的收縮反應(yīng)也表現(xiàn)出降低趨勢,與文獻報道相符。此外,模型組大鼠的胸主動脈對ACh引起的舒張作用幾乎沒有應(yīng)答,說明L-NAME造模大鼠血管的內(nèi)皮依賴性舒張功能也受到損傷,與前期的研究報道一致。這也進一步證實長期給予L-NAME可抑制血管內(nèi)皮來源的舒張因子NO的產(chǎn)生,造成內(nèi)皮功能障礙。內(nèi)皮功能損傷是引發(fā)高血壓的重要機制之一,因而L-NAME誘導(dǎo)的血管舒張功能損傷又可引發(fā)血管收縮功能的異常,進而導(dǎo)致大鼠的血壓持續(xù)升高。本實驗中