富硒猴頭菇對(duì)小鼠腸道菌群的影響

富硒猴頭菇對(duì)小鼠腸道菌群的影響

猴頭是屬于擔(dān)子菌亞門(mén)、異距雞子菌亞門(mén)、無(wú)距雞子菌亞門(mén)、無(wú)褶皺菌、猴頭菌科、虎頭菌科。猴頭及其提取物廣泛用于胃腸道疾病特別是對(duì)胃腸道炎癥和潰瘍以及消化道癌癥輔助的治療。有人對(duì)猴頭菌制備物(猴頭菌子實(shí)體制備液、猴頭菌深層培養(yǎng)物以及猴頭菌多糖)的抑菌活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn),證明猴頭菌各制備物對(duì)細(xì)菌、酵母菌和霉菌均有不同程度的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,有機(jī)硒有著很強(qiáng)抗菌活性,有顯著減少小鼠腸道中的大腸埃希菌數(shù)量的效果。許多補(bǔ)益類(lèi)中草藥對(duì)雙歧桿菌、嗜乳酸桿菌有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用,包括枸杞子、地黃、五味子、黃芪和白術(shù)等。本文將考察富硒猴頭凍干粉對(duì)小鼠腸道菌群的影響,判斷其是否具有調(diào)節(jié)腸道菌群的效果。1材料和方法1.1頭菇凍干粉的制備猴頭菇凍干粉,由猴頭菇鮮品冷凍干燥制得。富硒猴頭菇凍干粉是在猴頭菇培養(yǎng)基中加入亞硒酸鈉培養(yǎng),冷凍干燥制得,樣品中有機(jī)硒含量156μg/g。昆明小鼠,雄性,清潔級(jí),體重18～22g。1.2給藥劑量及給藥時(shí)間50只小鼠隨機(jī)分為5組,分別為蒸餾水對(duì)照組,普通猴頭菇凍干粉組和富硒猴頭菇凍干粉高、中和低3個(gè)劑量組,每組10只。高、中和低劑量組分別給予富硒猴頭菇凍干粉3、0.3和0.03g/(d·kg·BW)。普通猴頭菇凍干粉對(duì)照組給予0.3g/(d·kg·BW)普通猴頭菇凍干粉,空白對(duì)照給予等量蒸餾水。灌胃給藥,灌胃容量0.3ml/10g體重。每天1次,持續(xù)3周。除灌胃外,小鼠給予正常飼料和飲水。1.3新鮮糞便的采集分別在灌胃前,灌胃后第21天,停止灌胃后3d無(wú)菌采集新鮮糞便樣。輕壓小鼠直腸部位在無(wú)菌環(huán)境下收集新鮮糞便,裝于事先滅菌的EP管中,每組實(shí)驗(yàn)小鼠收集5個(gè)標(biāo)本。立即將EP管封口,記錄重量,-20℃冷凍保存。1.4u3000結(jié)論DNA的提取:根據(jù)楊美芬等的方法,糞便樣本加9倍體積的PBS(0.05mol/L,pH7.4)充分混勻,低速離心(1500r/min)5min,取上清,重復(fù)上述過(guò)程3次。合并上清,高速離心(10000r/min)3min取沉淀,沉淀用PBS洗3次,水洗1次,加入50μl水和50μl1%TritonX-100,100℃煮沸5min立即投入冰水中備用。DNA的純化:將提取步驟所得液體高速離心(14000r/min)1min取上清,加入等體積酚、氯仿,振蕩10s,高速離心10min取上清,加入2～2.5倍4℃95%乙醇,液氮冷凍20min后高速離心1min,取沉淀,乙醇重復(fù)沉淀1次,揮干乙醇,加入50μlTE,-20℃保存。1.5保菌劑的制備取大腸埃希菌和乳酸菌培養(yǎng)好的菌液(菌種來(lái)源:實(shí)驗(yàn)室保藏),用血球計(jì)數(shù)板確定濃度(大腸埃希菌濃度為4.4×107CFU/ml,乳酸菌濃度為1.86×107CFU/ml),取1ml菌液,10000r/min離心3min,PBS清洗,破碎,純化步驟同1.4。雙歧桿菌用PCR產(chǎn)物,測(cè)定A值。參照分子克隆,計(jì)算出拷貝數(shù)。1.6pcr反應(yīng)taq酶活性。引物特異性:取各DNA標(biāo)準(zhǔn)品與一個(gè)糞便樣品DNA進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為25μl:10×Buffer2.5μl,0.25mol/L4×dNTP0.5μl,25mmol/LMgCl22.5ml,2μmol/L上下游引物各0.5μl,5U/μlTaq酶0.15μl,DNA模板3μl,水15.35μl。反應(yīng)程序?yàn)?95℃5min后,95℃15s,55℃1min,72℃45s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃10min延伸結(jié)束。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。1.7熒光定量pcrre作cy標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作,將1.5所得DNA做10倍系列稀釋,進(jìn)行SYBRGreenⅠ作為熒光染料的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25μl:SYBRPremixExTaqTM12.5μl,ROXReferenceDye0.5μl,上下游引物各0.5μl,模板2μl,水9μl。采用ABIPRISM7500FastReal-TimePCRSystem進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min,95℃15s,60℃1min,80℃10s,讀取熒光數(shù)據(jù),共40個(gè)循環(huán);反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析,從60℃到95℃緩慢升溫,檢測(cè)熒光數(shù)據(jù)。根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù),由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析Ct值并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品的16SrDNA定量分析,將各糞便DNA樣本分別進(jìn)行3種細(xì)菌的16SrDNA熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同。每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔。樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到各樣品中3種細(xì)菌的數(shù)量。1.8組患者xss的比較樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,應(yīng)用單因素方差分析比較組間差異。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以P≤0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠腸道pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性分析用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析,可見(jiàn),各標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物均顯示出特異性條帶,與預(yù)期的DNA片段長(zhǎng)度相吻合。糞便樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物除目標(biāo)條帶外,并無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增條帶?？梢?jiàn)各引物特異性較好,適合用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)(見(jiàn)圖1)。2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線(xiàn)以不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo)得到各細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),各菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2所示。每次反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析,可見(jiàn)溶解曲線(xiàn)均為單峰,說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一(圖3)。擴(kuò)增產(chǎn)物的TM值分別為:大腸埃希菌屬81.24;乳酸桿菌屬84.82;雙歧桿菌屬88.55。與預(yù)期產(chǎn)物TM值相符,說(shuō)明所得擴(kuò)增曲線(xiàn)為目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)增曲線(xiàn)。2.3高劑量富硒猴頭菇凍干粉對(duì)小鼠糞便中雙歧桿菌的影響實(shí)驗(yàn)期間小鼠糞便中腸桿菌屬的變化見(jiàn)表3所示,實(shí)驗(yàn)期間小鼠糞便中腸桿菌屬與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)。經(jīng)口給予富硒猴頭菇凍干粉21d后,小鼠腸道中的大腸埃希菌生長(zhǎng)繁殖未受明顯抑制。對(duì)小鼠腸道雙歧桿菌數(shù)量的影響見(jiàn)表4所示。灌胃富硒猴頭菇凍干粉后,實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便雙歧桿菌數(shù)量有所增加,與對(duì)照組相比達(dá)到顯著水平(P<0.05),但高劑量灌胃富硒猴頭菇凍干粉后,小鼠糞便中的雙歧桿菌數(shù)量與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是由于雙歧桿菌對(duì)于腸道環(huán)境中的硒濃度較為敏感,實(shí)驗(yàn)高劑量組的小鼠腸道中的硒濃度過(guò)高,對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖表現(xiàn)出一定程度的抑制作用。實(shí)驗(yàn)期間小鼠糞便中乳酸菌的變化見(jiàn)表5所示,對(duì)照組小鼠糞便中腸桿菌屬無(wú)明顯變化,實(shí)驗(yàn)期間菌數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)口給予富硒猴頭菇凍干粉以后,高劑量組小鼠腸道中乳酸菌的數(shù)量增加,達(dá)到顯著水平(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第3天,實(shí)驗(yàn)組小鼠乳酸菌數(shù)量與對(duì)照相比仍然較多。說(shuō)明富硒猴頭菇凍干粉對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖有一定的促進(jìn)作用。2.4富碘雞干粉對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體重的影響實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組小鼠與正常對(duì)照組相比,體重均無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束解剖小鼠,未見(jiàn)異常。3腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)口給予富硒猴頭菇凍干粉21d后,小鼠腸道中有益菌乳酸菌的增殖得到促進(jìn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),證明了富硒猴頭菇凍干粉對(duì)小鼠腸道菌有一定的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束3d后,小鼠腸道中乳酸菌數(shù)量與對(duì)照相比仍然較多,但雙歧桿菌數(shù)量恢復(fù)正常。與普通猴頭對(duì)照相比,富硒猴頭菇對(duì)乳酸菌的調(diào)節(jié)效果在3d后仍然保持(P<0.05),在調(diào)節(jié)腸道菌群方面有一定的優(yōu)勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)的給藥濃度范圍內(nèi),未見(jiàn)對(duì)腸道中大腸埃希菌生長(zhǎng)繁殖的抑制。富硒猴頭菇可能是通過(guò)其中含有的單糖,多糖等成分對(duì)小鼠腸道中的有益菌產(chǎn)生影響,而調(diào)節(jié)效果的持續(xù)的原因可能是有機(jī)硒成分作用與免疫系統(tǒng)而改善腸道環(huán)境。富硒猴頭菇對(duì)腸道菌群影響的實(shí)際作用機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。猴頭菌促進(jìn)兩種益生菌生長(zhǎng)的原因可能為:猴頭中的糖分經(jīng)腸道酶類(lèi)分解成低聚糖類(lèi),如海藻糖,β-葡聚糖等,能促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。猴頭菇中的硫胺素、核黃素等也是重要的益生菌促生長(zhǎng)物質(zhì)。猴頭多糖經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生VFA(揮發(fā)性脂肪酸),VFA是腸道中抑制病原微生物的重要因素。高濃度的VFA可明顯抑制沙門(mén)菌等的生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)也可降低腸道pH,從而抑制某些pH敏感菌的生長(zhǎng),促進(jìn)益生菌增值。硒作為GPx活性中心,腸道環(huán)境中硒含量的增加,將使菌體內(nèi)GPx活性增強(qiáng),起到清除自由基、解過(guò)多的過(guò)氧化氫、保護(hù)細(xì)胞膜的作用。另外,有研究表明GPx的類(lèi)似物Se-2F3-ScFv能夠阻止LDH(乳酸脫氫酶)的釋放并保持其在正常水平內(nèi)恒定。而LDH作為乳酸菌代謝的重要酶類(lèi),能夠催化乳酸菌產(chǎn)生乳酸。以降低腸道環(huán)境中的pH,抑制有害菌生長(zhǎng)。市面上最常見(jiàn)的腸道菌群調(diào)節(jié)劑為益生菌活菌制劑,易受抗生素影響,而富硒猴頭菌通過(guò)不同于活菌制劑的途徑調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),抗生素對(duì)其影響較小。且硒是谷胱甘肽氧化酶(GSH-PX)的組成部分,在代謝中傳遞電子,具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤的作用。富硒猴頭菇含有豐富的硒,能夠提高機(jī)體抗氧化能力,起到抗炎作用。對(duì)于接受抗生素治療的胃腸道炎癥患者,富硒猴頭菇不失為一種優(yōu)秀的腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。實(shí)驗(yàn)證明富硒猴頭調(diào)節(jié)乳酸菌數(shù)量的作用在實(shí)驗(yàn)結(jié)束3天后仍然持續(xù)。硒提高宿主非特異性免疫功能,提高抵抗抗病原菌的能力。并且能夠增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞增殖功能,增強(qiáng)體液免疫?？赡芡ㄟ^(guò)免疫系統(tǒng)影響致病菌在腸道上皮細(xì)胞的粘附,使腸道內(nèi)形成一個(gè)較為穩(wěn)定的環(huán)境為乳酸菌的穩(wěn)定造了條件。并且,硒進(jìn)入到乳酸菌菌體內(nèi),參與多種酶的作用,尤其的作為GPx氧化應(yīng)激系統(tǒng)中酶的活性中心,起著抗氧化保護(hù)細(xì)胞的作用。硒的摻入保護(hù)了乳酸菌體氧化還原物質(zhì)的穩(wěn)定,起到保護(hù)菌體的作用。從而使乳酸菌數(shù)量穩(wěn)定,使調(diào)節(jié)效果得到持續(xù)。猴頭菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用,而有富硒猴頭中的有機(jī)硒成分使其調(diào)節(jié)效果具有一定持續(xù)性。