超譜-內(nèi)酰胺酶法檢測10種大腸桿菌的敏感性

超譜-內(nèi)酰胺酶法檢測10種大腸桿菌的敏感性

0細(xì)菌耐藥機(jī)制近年來，隨著抗癲癇藥物臨床應(yīng)用的日益增多，尤其是抗癲癇藥物和新抗生素的廣泛臨床應(yīng)用，抗癲癇藥物已成為世界的熱門話題。其中，腸桿菌是目前臨床感染中最重要的細(xì)菌，對抗生素的抗性作用更為顯著。細(xì)菌的耐藥性是普遍的。細(xì)菌耐藥性的原因是多方面的。另一方面，細(xì)菌本身具有明顯的適應(yīng)性和驚人的多樣性。除了細(xì)菌本身固有的抗性外，細(xì)菌還可以通過接觸、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化等方式從染色體、顆粒和其他來源突變，從而達(dá)到細(xì)菌獲得有效的抗劑性。另一方面，在抗癲癇藥物方面，大量光譜抗生素的應(yīng)用，尤其是抗癲癇藥物的使用，可以很容易地選擇抗癲癇藥物。因此，為了準(zhǔn)確檢測抗癲癇藥物，了解細(xì)菌的分布和服藥，預(yù)防和緩解細(xì)菌藥物的耐藥性，引導(dǎo)醫(yī)生合理使用抗生素，控制傳染病的傳播和流行。β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗生素之一,研究表明,細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的最主要機(jī)制是由于β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生,而且隨著抗生素的大量應(yīng)用,這些酶種類不斷增多,由于突變逐漸增加,還導(dǎo)致了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的發(fā)展.最常見的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是由TEM和SHV基因突變引起的,主要在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn),產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的菌株還可引起爆發(fā)集團(tuán)性的感染,而且由于其水解活性較強(qiáng),可水解目前臨床常用的三代及四代頭孢菌素,大大增加了臨床治療的費(fèi)用,給臨床抗感染治療帶來了極大的困難,因此對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究也成為近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn).1材料和方法1.1材料表面1.1.1日本大坂大學(xué)基因克隆實(shí)驗(yàn)菌10220日本大坂大學(xué)基因克隆實(shí)驗(yàn)菌;10221日本大坂大學(xué)基因克隆實(shí)驗(yàn)菌;10222日本大坂大學(xué)基因克隆實(shí)驗(yàn)菌;10223日本大坂大學(xué)基因克隆實(shí)驗(yàn)菌;10224日本大坂大學(xué)基因克隆實(shí)驗(yàn)菌;10242日本大坂大學(xué)氨基酸分子育種菌;10243日本大坂大學(xué)氨基酸分子育種菌;10244中國科學(xué)院基因克隆受體菌;10245日本大坂大學(xué)苯丙氨酸分子育種受體菌;10246中國科學(xué)院基因克隆受體菌;以上菌種均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心,中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院.菌種保藏于4℃冷藏室中,斜面的保藏時(shí)間為1個(gè)月,冷凍管保藏時(shí)間為5～10年以上.1.1.2微生物試劑0.5麥?zhǔn)媳葷峁馨鼻?AZT,30μg/片)、氨芐西林(AMP,10μg/片)、阿莫西林(AMX,10μg/片)、頭孢噻肟(CTX,30μg/片)、頭孢呋辛鈉(CXM,30μg/片)、氯霉素(C,30μg/片)、克林霉素(CM,2μg/片)、環(huán)丙沙星(CIP,5μg/片)、頭孢噻吩(CF,30μg/片)、頭孢他啶(CAZ,30μg/片)、頭孢唑啉(CZ,30μg/片)、磷霉素(FOS,200μg/片)、哌拉西林(PIP,100μg/片)、多粘菌素B(PB,300IU/片)、青霉素(P,100IU/片)、諾氟沙星(NOR,10μg/片)、鏈霉素(S,10μg/片)、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶(SXT,32.75/1.2μg/5)、苯唑西林(OX,1μg/片)、妥布霉素(TM,10μg/片)、四環(huán)素(TE,30μg/片)、利福平(RA,5μg/片)、卡那霉素(K,30μg/片)、慶大霉素(GM,120μg/)、復(fù)方新諾明(SXT,10μg/片)、萬古霉素(VA,30μg/片)、紅霉素(E,15μg/片)左氧氟沙星(LVF,5μg/片)、萘啶酸(NAL,30μg/片),購自杭州天和微生物試劑有限公司,均在有效期之內(nèi).1.1.3培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基及牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基.均按常規(guī)操作進(jìn)行配制.1.2方法1.2.1細(xì)菌的培養(yǎng)將10種大腸桿菌接種于平板培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱,按常規(guī)方法培養(yǎng),培養(yǎng)箱溫度要求在35±1℃.1.2.2抑菌圈、抑菌圈的測定10種大腸桿菌均采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer即K-B法)進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn).方法如下:(1)選取平板純培養(yǎng)的單個(gè)菌落,用生理鹽水將濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)瞎軡岫?(2)吸取約0.1mL的菌液進(jìn)行平板涂布,均勻涂布三次,每次旋轉(zhuǎn)平板60°.(3)置室溫下干燥3～5min,貼上抗生素紙片,紙片與紙片的距離不得小于24mm.(4)35℃培養(yǎng)16～18h.(5)用卡尺測量其抑菌圈直徑.(6)按照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2006年版的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果,以敏感(susceptibleS)、中介(intermediateI)、耐藥(resistantR)報(bào)告結(jié)果.1.2.3esb的檢測(1)esbls菌株的篩選表型篩選,操作與結(jié)果判讀根據(jù)CLSI(2006年)推薦的標(biāo)準(zhǔn),即CAZ(30μg)抑菌環(huán)直徑≦22mm或CTX(30μg)抑菌環(huán)直徑≦27mm,提示判定為疑產(chǎn)ESBLs菌株;(2)esbls型菌株將ESBLs試條貼在平板表面,濾紙片一面接觸培養(yǎng)基,膠面朝上,35℃培養(yǎng)16～18h.含有棒酸紙片(有顏色端)的抑菌圈大于另一紙片(無顏色端)的5mm以上,為產(chǎn)ESBLs菌株,大腸埃希氏菌ATCC25922為陰性質(zhì)控菌株.2結(jié)果與分析2.1抗菌藥物的應(yīng)用10種大腸桿菌對30種抗生素的藥敏測試結(jié)果,見表1和圖1所示.在這30種抗生素中,10種大腸桿菌對約70%左右的抗生素敏感,對約20%的抗生素表現(xiàn)為耐藥,其余表現(xiàn)為中介.氯霉素、頭孢唑啉、磷霉素、諾氟沙星、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、妥布霉素、氧氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、萘啶酸這12種抗生素對10種大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用,其抑菌圈直徑平均大于20mm,可合理用于臨床治療大腸桿菌類疾病;克林霉素、鏈霉素、苯唑西林、利福平、萬古霉素、紅霉素這6種抗生素對10種大腸桿菌的抑制作用最弱,抑菌直徑平均小于10mm,此類藥物對大腸桿菌類疾病治療基本失效.2.2esbls的耐藥情況對10種大腸桿菌按美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2006年版的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的初篩和確證試驗(yàn),見表3和表4.初篩5株大腸桿菌判定為疑產(chǎn)ESBLs菌株,分別為10220、10223、10224、10242、10245,經(jīng)過確證試驗(yàn)檢出產(chǎn)ESBLs大腸桿菌2株,分別為10224和10242.產(chǎn)ESBLs的2種大腸桿菌10224和10242對30種抗生素的耐藥率皆為26.7%,敏感率分別為60.0%和66.7%,耐藥率較非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌高,其中大腸桿菌10224和10242對鏈霉素、萬古霉素的抑菌直徑皆為0mm,10242對克林霉素、鏈霉素、苯唑西林、利福平、萬古霉素、紅霉素也無抑制作用.3耐藥情況的檢測對常用的30種抗生素進(jìn)行藥敏測試,10種大腸桿菌對約70%左右的抗生素表現(xiàn)為敏感,對約20%的抗生素表現(xiàn)為耐藥,其余表現(xiàn)為中介.對氯霉素、頭孢唑啉、磷霉素、諾氟沙星、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、妥布霉素、氧氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、萘啶酸這12種抗生素表現(xiàn)出極高的敏感性.運(yùn)用超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢測出2株產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌,分別為10224和10242,耐藥率較非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌高.4產(chǎn)酶菌株的確定細(xì)菌的耐藥變異是在抗菌藥物選擇壓力下,細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境進(jìn)化的結(jié)果.近年來,腸桿菌科的細(xì)菌中產(chǎn)ESBLs菌株的數(shù)量和產(chǎn)酶率都呈增長趨勢.產(chǎn)ESBLs腸菌株對多種抗菌藥交叉耐藥且耐酶逐年增加.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極開展對產(chǎn)酶細(xì)菌的檢測,嚴(yán)格遵循