穿破石對四氯化碳小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

穿破石對四氯化碳小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

穿刺巖石是屬于?？普芟档闹参锝Y(jié)構(gòu)（cudural）1udoetmasam1或cudralcudral1（kar1）bu的根。目前,穿破石臨床上可以有效地治療急慢性肝炎。為探討穿破石抗急性肝損傷的作用機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)研究穿破石水提取物和醇提取物抗CCl4致小鼠急性肝損傷的作用。1材料和機(jī)器1.1特芬材料穿破石,采自廣西龍虎山,挖出植物根部,除去須根,洗凈,切段曬干備用。經(jīng)本所生藥室梁定仁主任鑒定,為桑科植物構(gòu)棘的根。1.2動物生產(chǎn)許可證昆明小鼠90只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22g。由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,SPF級小鼠,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK桂2009-0002,動物質(zhì)量合格證號:0001772。1.3實(shí)驗(yàn)室條件室內(nèi)溫度22~28℃,相對濕度為40%~70%,照明時間隨同自然變化。1.4聯(lián)苯雙酯滴丸、ccl4ALT、AST、MDA、SOD、TP試劑盒由南京建成生物工程研究所,批號20110720。聯(lián)苯雙酯滴丸由浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生產(chǎn),批號110102。CCl4由天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn),批號20091108。橄欖油由上海提頓進(jìn)出口有限公司,批號20100521,酸度7.5%。1.5自動生化分析方法島津UV-2401PC型紫外可見分光光度計;日立7020型全自動生化分析儀;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);恒溫水浴鍋(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。2組織病理學(xué)檢測2.1穿破石水提取物的提取穿破石藥材粗粉,用10倍體積的蒸餾水于不銹鋼鍋中浸泡完全后加熱水煮,藥液煮沸后調(diào)整溫度致藥液微沸,繼續(xù)水煮1.5h后,濾出藥液,重復(fù)3次,將3次濾出的藥液合并濃縮,得到穿破石水提取物。2.2穿破石醇提取物的提取穿破石藥材粗粉,用10倍體積的80%乙醇于10000ml中浸泡完全后水浴加熱回流,藥液煮沸后調(diào)整溫度致藥液微沸,繼續(xù)水浴加熱回流1.5h后,濾出藥液,重復(fù)3次,將3次濾出的藥液合并濃縮,得到穿破石醇提取物。2.3分組和給藥昆明種小鼠90只,雌雄各半,將小鼠隨機(jī)分成9組,每組10只。分別為正常組、CCl4模型組、陽性藥聯(lián)苯雙酯組(30mg/ml)、穿破石水提取物和醇提取物高(0.325g/ml)、中(0.216g/ml)、低(0.108g/ml)6個劑量組。實(shí)驗(yàn)開始時,陽性藥聯(lián)苯雙酯組及穿破石水提取物和醇提取物高、中、低6個劑量組按0.2ml/10g,ig給藥,每天1次,連續(xù)8d,模型組和正常組分別給予同體積蒸餾水。于第8天給藥3h后,除正常組外,每只小鼠ip10ml/kg,0.1%CCl4橄欖油溶液。造模16h后,摘眼球取血(取血前12h禁食,不禁水),于4℃下,以3000r/min×10min冷凍離心,分離血清待測。采血后,快速斷頭處死,取肝臟稱重,取肝右葉組織約0.1g,在冰冷的生理鹽水中漂洗,濾紙拭干,用生理鹽水制成10%肝組織勻漿,于4℃下,以3000r/min×10min冷凍離心,取上清待測。各指標(biāo)按試劑盒操作說明進(jìn)行測定。2.4統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)輸入計算機(jī)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)計,計算結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示。組間采用t檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1小鼠肝臟組織病理學(xué)檢測正常組小鼠肝臟外觀呈紅褐色,質(zhì)地軟而富有彈性。模型組、穿破石水提取物和醇提取物各劑量組小鼠肝臟表面呈黃褐色、有花斑樣病變;模型組小鼠肝臟表面花斑樣病變程度重于穿破石水提取物和醇提取物各劑量組小鼠肝臟。3.2alt和ast活性結(jié)果表明,腹腔注射CCl4可引起小鼠急性肝損傷,表現(xiàn)在血清中ALT、AST活性明顯升高。穿破石水提取物和醇提取物高、中、低6個劑量組均使其升高的ALT、AST活性顯著降低(P<0.05),提示穿破石對CCl4引起的小鼠急性肝損傷有很好的保護(hù)作用。結(jié)果見表1。3.3穿破石水提取物對肝組織抗氧化及清除氧自由基的影響從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯升高(P<0.05),SOD活性顯著下降(P<0.05),提示肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化。穿破石水提取物高、中劑量組可顯著抑制肝組織中MDA的升高及SOD活性的降低(P<0.05),提示穿破石水提取物高、中劑量組有較強(qiáng)的抗氧化及清除氧自由基的作用。穿破石醇提取物高劑量組可顯著抑制肝組織中MDA的升高及SOD活性的降低(P<0.05),提示穿破石醇提取物高劑量組有較強(qiáng)的抗氧化及清除氧自由基的作用。穿破石水提取物和醇提取物對TP水平無影響。結(jié)果見表2。4對ccl4所致急性肝損傷模型小鼠肝組織勻漿中sod和ast的影響生長于廣西龍虎山的穿破石,廣泛地在廣西民間使用,具有祛風(fēng)利濕、活血通經(jīng)的功能,可治風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛,黃疸,淋濁,蠱脹,閉經(jīng),勞傷咳血,跌打損傷,疔瘡癰腫,在臨床上治療急慢性肝炎很有效。目前,國內(nèi)對廣西境內(nèi)穿破石作用機(jī)理研究很少,特別是有關(guān)于穿破石抗急性肝損傷和肝纖維化方面的研究。近年來研究表明,肝損傷是多因素參與的復(fù)雜過程,自由基和脂質(zhì)過氧化在肝損傷中起著十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用CCl4所致急性肝損傷模型是最常用經(jīng)典模型之一。CCl4是一種毒性很強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì),進(jìn)入機(jī)體后,在肝臟內(nèi)經(jīng)肝細(xì)胞色素P450激活,生成三氯甲基自由基(CCl3·)和氯自由基(CL·),導(dǎo)致肝微粒體的脂質(zhì)過氧化。由于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)而抗氧化能力降低導(dǎo)致自由基增多,進(jìn)而攻擊脂質(zhì)細(xì)胞膜,引起肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化性損傷,使肝細(xì)胞變性壞死,細(xì)胞內(nèi)ALT、AST大量釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,穿破石能顯著降低CCl4引起小鼠急性肝損傷后血清中ALT和AST水平,從而證實(shí)了穿破石水提取物和醇提取物能減輕CCl4所致小鼠急性肝損傷。目前研究表明,自由基(超氧離子自由基和羥自由基)是啟動脂質(zhì)過氧化的關(guān)鍵因素,其含量越高則肝損傷程度就越嚴(yán)重。SOD是超氧陰離子自由基的清除劑,可抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化。而MDA能使膜蛋白、酶發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),使膜通透性增加,導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生改變,對機(jī)體造成損害。肝臟MDA活性的高低不僅能反映肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)弱,而且反映肝臟損傷的程度。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,穿破石水提取物和醇提取物可升高CCl4所致急性肝損傷模