流式細(xì)胞儀結(jié)果分析

流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用1整理課件流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)2整理課件流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。

特點(diǎn)：檢測(cè)速度快、檢測(cè)通量高、單細(xì)胞多參數(shù)的檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)3整理課件流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選根底上開(kāi)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)〔如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等〕進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。流式流式細(xì)胞儀儀流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀4整理課件樣本來(lái)源：各種細(xì)胞〔如外周血，骨髓，實(shí)體組織、懸浮或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞〕，微生物，人工合成微球等。檢測(cè)大?。阂话闶?.5um～40um流式細(xì)胞儀可以做什么？5整理課件液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

分析型流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀的組成6整理課件〔1〕液流液流系統(tǒng)流動(dòng)室流動(dòng)室〔Flowcell〕是液流系統(tǒng)的核心部件，流動(dòng)室是由石英玻璃制成，單細(xì)胞懸液在流動(dòng)室里被鞘液流包繞通過(guò)流動(dòng)室內(nèi)一定孔徑的孔，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，細(xì)胞在此與激光垂直相交。7整理課件層流水力聚焦技術(shù)8整理課件光學(xué)系統(tǒng)—LightscatteringatFSCrepresentstheparticlesizeandarea—LightscatteringatSSCdependsongranularityandcomplexityoftheparticle9整理課件激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過(guò)短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS〔散射光〕，F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4〔熒光〕光學(xué)系統(tǒng)10整理課件FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學(xué)系統(tǒng)示意圖11整理課件主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成〔3〕數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)12整理課件根本工作原理13整理課件單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之根本過(guò)程14整理課件細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測(cè)定15整理課件16整理課件 前向散射光〔forwardscatter,FS〕：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的外表屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。17整理課件FALSSensorLaser前向散射光示意圖18整理課件 側(cè)向散射光〔sidescatter,SS〕：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。19整理課件FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光示意圖20整理課件 測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的根本原理，但不能分析外表分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

21整理課件熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放大器三、熒光測(cè)量22整理課件熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)23整理課件24整理課件熒光補(bǔ)償25整理課件通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。四、細(xì)胞分選原理26整理課件細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電〔一〕分選根本原理27整理課件分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比?！捕撤诌x的技術(shù)要求28整理課件參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式〔單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖〕設(shè)門分析技術(shù)第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析29整理課件FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)30整理課件單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式31整理課件由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少?！惨弧硢螀?shù)直方圖32整理課件單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel)33整理課件雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。〔二〕雙參數(shù)直方圖34整理課件1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度35整理課件雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖36整理課件2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高〞。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集那么表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。37整理課件二維等高圖38整理課件3.假三維等高圖39整理課件〔三〕三參數(shù)直方圖40整理課件多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。〔四〕流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析41整理課件Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只表達(dá)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設(shè)門分析技術(shù)42整理課件A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門43整理課件線性門44整理課件Region設(shè)置:區(qū)閾〔region,R〕與門(gate,G)是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門。45整理課件D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。

46整理課件第四節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

樣本制備標(biāo)記染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制47整理課件外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備 別離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備蛋白酶消化機(jī)械吹打使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液一、免疫檢測(cè)樣品制備48整理課件新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法外表活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法〔一年〕乙醇或甲醇保存法〔2周〕甲醛或多聚甲醛保存法〔2月〕49整理課件適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色50整理課件FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類〔一〕幾種常見(jiàn)的熒光染料51整理課件名稱染料激發(fā)波長(zhǎng)熒光顏色溶解性對(duì)PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料52整理課件 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料53整理課件PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制54整理課件熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式 結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價(jià)鍵結(jié)合 熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法 直標(biāo):干擾少,但需購(gòu)置多種單抗 間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體 組合標(biāo)記〔二〕免疫熒光標(biāo)記55整理課件免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對(duì)不同檢測(cè)物的乳膠微球混合后再參加待標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測(cè)特產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)行定量分析。因檢測(cè)速度極快，所以又有“液相芯片〞之稱。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用56整理課件微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色〔固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片那么是用顏色來(lái)編碼〕57整理課件58整理課件通過(guò)對(duì)標(biāo)記不同熒光素分子的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)FCM對(duì)可溶性物質(zhì)的定量分析59整理課件四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細(xì)胞實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2〔一〕單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控60整理課件溫度pH染料濃度固定劑〔二〕免疫熒光染色的質(zhì)控61整理課件光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異〔CV〕。PMT〔光電倍增管〕校準(zhǔn):保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最正確靈敏度工作狀態(tài)。絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn):保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。Flow-checkFlow-setFlow-count〔三〕儀器操作的質(zhì)控62整理課件同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：與待測(cè)標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測(cè)，結(jié)果達(dá)靶值，提示本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。〔四〕免疫檢測(cè)的質(zhì)控63整理課件第四節(jié)在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)根底研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞外表的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。64整理課件T淋巴細(xì)胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細(xì)胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體,參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)

B2(CD19+CD5-):受外來(lái)抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細(xì)胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析65整理課件二、淋巴細(xì)胞功能分析細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)(死細(xì)胞與活細(xì)胞比例)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對(duì)淋巴瘤和白血病進(jìn)行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預(yù)后及檢出微小殘留病變66整理課件CD4+Th細(xì)胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對(duì)化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用67整理課件HLA-B27可出現(xiàn)在58%～97%的強(qiáng)直性脊椎炎(As)患者 六、自身免疫病相關(guān)HLA抗原分析68整理課件七、移植免疫中的應(yīng)用FCM作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，已應(yīng)用于