轉(zhuǎn)基因蘋果研究現(xiàn)狀與展望

.頁(yè)眉.頁(yè)腳..轉(zhuǎn)基因蘋果研究現(xiàn)狀與展望摘要：從轉(zhuǎn)基因蘋果受體基因型、選擇標(biāo)記基因、報(bào)告基因及外源基因等方面綜述了轉(zhuǎn)基因蘋果研究現(xiàn)狀，著重論述了外源基因在轉(zhuǎn)基因蘋果中的應(yīng)用。同時(shí)綜合文獻(xiàn)提出了蘋果轉(zhuǎn)基因研究存在的問(wèn)題和今后的研究方向。關(guān)鍵詞：蘋果；轉(zhuǎn)基因；基因型；外源基因；ProspectandResearchStatusofTransgenicApplesAbstract:Thispaperreviewedthepresentsituationoftransgenicapplesfromthegenotypeoftransgenicapplesreceptors，selectivemarkergene，reportergeneandexogenousgeneandsoon，moreover,theapplicationofexogenousgeneintransgenicapplesweremainlydiscussed．Meanwhile，problemsinthestudyoftransgenicapplesandtheresearchdirectioninthefuturewereputforwardbysummarizingliterature．Keywords:Apple;Transgenic;Genotype;Exogenousgene蘋果是世界四大水果之一，是我國(guó)第一大水果，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。隨著社會(huì)的發(fā)展，培育優(yōu)良蘋果品種已經(jīng)成為廣大消費(fèi)者的迫切要求。目前，培育出的蘋果品種雖然已有800多個(gè)，但是培育具有綜合農(nóng)藝性狀的品種仍然是一大難題。其主要原因是:①蘋果是高度雜合的樹(shù)種，遺傳背景比較復(fù)雜，有性雜交后代廣泛分離，選育結(jié)果難以控制;②蘋果童期(5～7年)比較長(zhǎng)，育種周期長(zhǎng);③蘋果育種工作已有上百年的歷史，長(zhǎng)期的人為定向選育使蘋果品種的遺傳性趨于一致，基因型范圍越來(lái)越窄。以上原因?qū)μO果育種造成諸多不利影響，使培育具有優(yōu)良綜合農(nóng)藝性狀的蘋果品種極為困難。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為蘋果品種的遺傳改良提供了新的技術(shù)方法首先，轉(zhuǎn)基因技術(shù)只對(duì)個(gè)別性狀進(jìn)行改良即可獲得理性個(gè)體;其次，轉(zhuǎn)基因植株不存在童期問(wèn)題，可以縮短育種周期;最后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破物種界限，極大地豐富基因來(lái)源轉(zhuǎn)基因技術(shù)給蘋果育種工作展現(xiàn)了良好的前景，筆者就蘋果轉(zhuǎn)基因方面的研究進(jìn)展作一綜述。1蘋果轉(zhuǎn)基因受體基因型1989年James等首次獲得轉(zhuǎn)基因綠袖蘋果，此后，蘋果轉(zhuǎn)基因研究迅猛發(fā)展迄今為止，用于蘋果轉(zhuǎn)基因研究的受體基因型越來(lái)越多，除綠袖外，還包括M26、元帥、皇家嘎拉、嘎拉、Braeburn、Elstar、喬納金、富士、遼伏、Marshall、McIntoshM．9、M29、粉紅佳人(Pinkla-dy)、Jork9QueenCox、王林(Orin)、金矮生(Jon-agored)17個(gè)品種。2選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的植物中存在著轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，它們之間存在著生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)，需要插入選擇標(biāo)記基因來(lái)選擇轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)化植株植物基因工程中常用的選擇標(biāo)記基因主要有兩大類:一類是編碼抗生素抗性的基因，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Ⅱ(nptII)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)和二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等;另一類是編碼除草劑抗性的基因，如草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)在蘋果轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用最多的選擇標(biāo)記基因是nptⅡ，其作用原理是nptⅡ基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)酶促磷酸化使氨基糖苷類抗生素失活，從而解除毒性，使轉(zhuǎn)基因植物對(duì)卡那霉素巴龍霉素等氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生抗性。3報(bào)告基因報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測(cè)定，在轉(zhuǎn)化的早期階段可以快速檢測(cè)外源基因是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞組織或器官，并檢測(cè)其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因在蘋果轉(zhuǎn)基因研究中，常用的報(bào)告基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Ⅱ(nptII)β-葡萄糖醛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(gus)胭脂堿合成酶基因(nos)和綠色熒光蛋白基因(gfp)［19］等。4蘋果品種改良基因1989年James等首次獲得轉(zhuǎn)基因綠袖蘋果后，蘋果轉(zhuǎn)基因研究迅猛發(fā)展，外源基因涉及到改良植物性狀的目的基因范圍也越來(lái)越廣目前蘋果改良基因研究有以下幾個(gè)方向:抗病蟲(chóng)害基因開(kāi)花相關(guān)基因矮化植株基因促進(jìn)生根基因抗除草劑基因耐貯藏基因及調(diào)控基因等。4,1抗病基因在蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化中，抗病基因研究主要集中在抗火疫病(Erwiniaamylovora)方面與此相關(guān)的有CecropinB、AttacinA、SB-37、Shiva-1、AttacinE、hrpN、NPR1、MB39gene、mbr4、等基因CecropinBAttacinA和AttacinE是從天蠶體內(nèi)分離出來(lái)的細(xì)胞溶解酶蛋白;SB-37Shiva-1是人工合成的細(xì)胞溶解酶類似物此外還有抗真菌基因β-1，3-葡聚糖酶雙價(jià)基因、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因、stilbenesynthasegene、PGIP以及抗蘋果黑星病基因pinB。4,2抗蟲(chóng)基因到目前為止，導(dǎo)入蘋果的外源抗蟲(chóng)基因有抗鱗翅類和鞘翅類昆蟲(chóng)的CpTI基因、蘇云金桿菌毒蛋白基因(Bt)、生物素綁定蛋白基因、CpTI對(duì)于許多害蟲(chóng)都具有抗性，廣譜性是其應(yīng)用于植物基因工程最主要的優(yōu)點(diǎn);Bt是從蘇云金桿菌分離出的殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白(ICP)基因，ICP以原毒素形式存在，昆蟲(chóng)取食后，在消化道被活化，與腸道上特異性結(jié)合蛋白結(jié)合，使ICP全部或部分嵌合于細(xì)胞膜上，產(chǎn)生孔道，昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)停止進(jìn)食，最終死亡;生物素綁定蛋白基因通過(guò)表達(dá)抗生物素蛋白或卵白素蛋白提高蘋果的抗蟲(chóng)性。4,3開(kāi)花相關(guān)基因果樹(shù)童期長(zhǎng)的特點(diǎn)在很大程度上延長(zhǎng)了果樹(shù)的育種周期開(kāi)花相關(guān)基因的研究，為縮短果樹(shù)的童期，從而縮短育種周期提供了分子理論基礎(chǔ)目前已經(jīng)從多種植物上克隆到MdTFL、BpMADS4等基因，并應(yīng)用到蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化中MdTFL基因是從蘋果(Malus×domesti-caBorkh．)中克隆得到，該基因與擬南芥中的TERMINALFLOWER1(TFL1)基因?yàn)橥椿?，可以抑制花的分生組織形成Kotoda等向蘋果中轉(zhuǎn)入反義MdTFL基因可以抑制MdTFL的表達(dá)，從而使蘋果可以在嫁接8～15個(gè)月后就可以開(kāi)花BpMADS4是從歐洲白樺(Betulapendula)中克隆出的MADS-box家族基因，其主要在歐洲白樺的花序莖尖和根尖中表達(dá)，作用主要是促進(jìn)早起花的形成Flachowsky等將BpMADS4基因轉(zhuǎn)入蘋果Pinova中，3～4個(gè)月就可以開(kāi)花4,4矮化基因矮化栽培因具有結(jié)果早、品質(zhì)好、管理方便、品種更新快等優(yōu)點(diǎn)，已成為果樹(shù)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)。由于果樹(shù)有很長(zhǎng)的生命周期，使得傳統(tǒng)的育種方法選育矮化品種非常緩慢，利用基因工程技術(shù)可以大大提高矮化品種培育的速率。目前已經(jīng)從病原體農(nóng)桿菌中鑒定和克隆出一些與矮化有關(guān)的基因，在蘋果中得到應(yīng)用的主要有rolA、rolC、phyB、gai基因等Holefors等及Zhu等將rolA基因轉(zhuǎn)入砧木M26，獲得的轉(zhuǎn)化植株與對(duì)照相比，樹(shù)體矮小，節(jié)間縮短，樹(shù)葉面積減小。Holefors等獲得的轉(zhuǎn)化植株葉、根干重均降低，Zhu等獲得的轉(zhuǎn)化植株的根明顯縮短。Igarashi等將從擬南芥中克隆出的rolC基因轉(zhuǎn)入Marubakaidou砧木，獲得的轉(zhuǎn)基因植株有1～3個(gè)拷貝的rolC基因整合到基因組DNA中，轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間縮短、葉片面積減小、頂端優(yōu)勢(shì)減弱。2000年Hole-fors等將擬南芥phyB(光敏色素B)基因?qū)隡26獲得13個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因植株，該基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)過(guò)量表達(dá)。其中9個(gè)株系主干明顯縮短，13個(gè)株系的莖、根和植物體干重均降低。此外，Zhu等將從擬南芥中克隆出的gai基因?qū)胩O果砧木A2以及栽培品種Gravenstein和McIntosh中，得到的轉(zhuǎn)化植株大部分表現(xiàn)出矮化特征，同時(shí)還表現(xiàn)出節(jié)間距減小、節(jié)數(shù)變少等表型特征。轉(zhuǎn)基因植株的矮化使得節(jié)數(shù)變少，但是否可以縮短童期尚未見(jiàn)報(bào)道4.5促進(jìn)生根基因受基因型的影響，有些蘋果砧木采用扦插和壓條繁殖時(shí)，生根極其困難利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在一定程度上可以解決這一問(wèn)題Welander等將rolB基因?qū)胝枘綧26中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株根系對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性增強(qiáng)，生根能力也相應(yīng)提高Igarashi等將從擬南芥中克隆出的rolC基因轉(zhuǎn)入Marubakaidou砧木，獲得的轉(zhuǎn)基因植株除了表現(xiàn)植株矮化性狀外，其生根能力也有了相應(yīng)提高4.6抗除草劑基因隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)有能力通過(guò)遺傳工程的方法來(lái)培育耐除草劑的作物品種根據(jù)抗性機(jī)理不同，目前耐除草劑的基因工程主要有2種策略:①修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對(duì)除草劑不敏感，或促使其過(guò)量表達(dá)以使植物吸收除草劑后仍能進(jìn)行正常代謝;②引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒ALS的靶位點(diǎn)突變體在自然界中普遍存在，人們已在細(xì)菌酵母植物細(xì)胞培養(yǎng)物及種植于田間的作物中發(fā)現(xiàn)了這種突變酶將來(lái)自擬南芥的als基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化皇家嘎拉蘋果獲得轉(zhuǎn)基因植株在后續(xù)研究中，獲得的種子用60mg/L綠貧隆(Glean)噴灑檢測(cè)其抗性，發(fā)現(xiàn)als基因按1∶1分離比例穩(wěn)定遺傳。從鏈霉菌中分離出的編碼乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶的基因被稱為bar基因乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶具有使除草劑草丁膦代謝失活的作用其作用機(jī)制在于在乙酰CoA存在的情況下，乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶催化乙酰CoA與草丁膦的游離氨基結(jié)合，從而使草丁膦失去除草劑的活性Dolgov等把bar基因?qū)胩O果砧木No．545并獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株4.7耐貯藏基因蘋果在貯藏過(guò)程中，由于果實(shí)熟化過(guò)程難以控制，常常導(dǎo)致過(guò)熟腐爛，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失常規(guī)育種方法選育耐貯藏蘋果品種周期太長(zhǎng)效果不理想，不能滿足生產(chǎn)的需求近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改良蘋果貯藏性已經(jīng)有了一定的成效果實(shí)耐貯藏基因的研究主要集中在乙烯的合成途徑相關(guān)基因的研究上，乙烯在對(duì)蘋果果實(shí)的成熟轉(zhuǎn)變扮演著重要角色Pesis等向蘋果綠袖中轉(zhuǎn)入反義ACCS和ACCO基因，然后將轉(zhuǎn)基因蘋果果實(shí)0℃冷藏3個(gè)月，之后轉(zhuǎn)入20℃環(huán)境中存放結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)化的蘋果果實(shí)相比，轉(zhuǎn)基因蘋果的乙烯含量明顯降低，轉(zhuǎn)基因蘋果對(duì)蘋果貯藏過(guò)程中容易出現(xiàn)的虎皮病和苦陷病抑制效果不明顯4.8調(diào)控基因近20年來(lái)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行蘋果的遺傳改良取得了很大進(jìn)展，外源基因涉及到改良植物性狀的目的基因范圍也越來(lái)越廣很多轉(zhuǎn)基因植株的性狀在一定程度上得到了改良，但外源基因的表達(dá)強(qiáng)度不夠，其效果尚不盡人意2000年Gittins等提出遺傳改良作物轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)受限于組織特異性的編碼活性他們將非同源的SSURBCS3CPSRS1P和CaMV35S啟動(dòng)子，以及GUSA標(biāo)記基因連接轉(zhuǎn)入到蘋果綠袖中，研究了不同啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUSA在綠袖中不同組織的表達(dá)狀況研究表明，SSU啟動(dòng)子首先在蘋果的綠色營(yíng)養(yǎng)組織中起作用;在根部RBCS3C啟動(dòng)子活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SRS1啟動(dòng)子;SRS1啟動(dòng)子的活性在很大程度上依賴于光照2001年Gittins等又對(duì)Bras-sicanapusextA啟動(dòng)子的調(diào)控作用作了研究，結(jié)果表明該啟動(dòng)子在蘋果莖段中的調(diào)控作用非常明顯以上結(jié)果表明，不同基因在不同組織中有特異的啟動(dòng)方式，因此，改進(jìn)調(diào)控基因表達(dá)的特異啟動(dòng)子有助于提高目的基因的表達(dá)強(qiáng)度和減少表達(dá)蛋白的損耗。5存在問(wèn)題及前景展望5.1安全的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)目前由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一些限制性因素，在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中一般要與目的基因一起轉(zhuǎn)入1個(gè)篩選標(biāo)記基因常用的篩選標(biāo)記基因?yàn)榭股乜剐曰蚝涂钩輨┗?，大多?shù)的篩選標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化后也同時(shí)存在于轉(zhuǎn)基因植物中，因此引起了轉(zhuǎn)基因植物安全性問(wèn)題的討論如人們擔(dān)心抗生素抗性基因有可能從攝入的轉(zhuǎn)基因食物轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，從而使人體的消化道內(nèi)產(chǎn)生抗性菌株;另外，除草劑抗性基因也有可能在野外引起基因擴(kuò)散，造成超級(jí)雜草的出現(xiàn)盡管目前并沒(méi)有證據(jù)證明其危害性，但公眾對(duì)安全性的關(guān)注大大推遲了轉(zhuǎn)基因作物的商品化和市場(chǎng)運(yùn)作，從而阻礙了轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展因此，探索一種新的無(wú)抗性篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以更好地激勵(lì)植物基因工程技術(shù)盡快地應(yīng)用到生產(chǎn)之中5.2外源基因表達(dá)強(qiáng)度不夠盡管目前通過(guò)轉(zhuǎn)基因方式獲得了很多各種蘋果改良轉(zhuǎn)基因植株，如蘋果的抗病蟲(chóng)害轉(zhuǎn)基因雖然離體檢測(cè)其抗性有了一定程度的提高，但其效果并不能達(dá)到人們所期望的目標(biāo)所以應(yīng)該從基因表達(dá)調(diào)控以及特異性表達(dá)的啟動(dòng)子方面進(jìn)行研究，以盡可能地提高目的基因的表達(dá)強(qiáng)度5.3品種改良基因型范圍太窄蘋果轉(zhuǎn)基因研究主要集中在抗病蟲(chóng)害方面，而抗病基因研究又主要集中在抗火疫病方面，抗其他病害的基因很少有報(bào)道;以提高果實(shí)品質(zhì)及抗逆性如抗寒抗鹽堿等為目的的轉(zhuǎn)基因研究也不多見(jiàn)References［1］JAMESDJ，PASSEYAJ，BARBARADJ，etal．Genetictransformationofapple(MaluspumilaMill)usingadisarmedTi-binaryvector［J］.PlantCellRep，1989，7:658－661．［2］MAHESWARANG，WELANDERM，HUTCHINSONJF，etal．Transforma-tionofapplerootstockM26withAgrobacteriumtumefaciens［J］．JPlantPhysiol，1992，139(5):560－568．［3］SRISKANDARAJAHS，GOODWINPB，SPEIRSJ．Genetictransformationofapplescioncultivar‘Delicious’viaAgrobacteriumtumefaciens［J］．PlantCellTissOrg，1994,36(3):317－329．［4］JIALY，COHEND，ATKINSONR，etal．RegenerationoftransgenicplantsfromthecommercialapplecultivarRoyalGala［J］．PlantCellRep，1995，14(7):407－412．［5］SCHAARTJG，PUITEKJ，KOLOVAL，etal．Somemethodologicalas-pectsofappletransformationbyAgrobacterium［J］.Euphytica,1995,85(1/3):131－134．［6］PUITEKJ，SCHAARTJG．GeneticmodificationofthecommercialapplecultivarsGala，GoldenDeliciousandElstarviaanAgrobacteriumtumefa-ciens-mediatedtransformationmethod［J］．PlantSci，1996，119(1/2):125－133．［7］BONDTAD，EGGERMONTK，PENNINCKXI，etal．Agrobacteriummedi-atedtransformationofapple(MalusdomesticaBorkh):anassessmentoffactorsaffectingregenerationoftransgenicplant［J］．PlantCellRep，1996，15:549－554．［8］裴東，田穎川，劉群祿等．蘋果葉片再生的改進(jìn)及抗蟲(chóng)基因植株的獲得［J］．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，19(4):23－27．［9］BOLARJP，BROWNSK，NORELLIJL，etal.Factorsaffectingthetrans-formationof‘MarshallMcIntosh’applebyAgrobacteriumtumefaciens［J］．PlantCellTissOrg，1998，55(1):31－38．［10］ZHULH，HOLEFORSA，AHLMANA，etal．TransformationoftheapplerootstockM．9/29withtherolBgeneanditsinfluenceonrootingandgrowth［J］.PlantSci，2001，160(3):433－439．［11］SRISKANDDARAJAHS，GOODWINP．Coditioningpromotesregenerationandtransformationinappleleafexplants［J］．PlantCellTissOrg，1998，53(1):1－11．［12］SEDIRAM，HOLEFORSA，WELANDERM．ProtocolfortransformationoftheapplerootstockJork9withtherolBgeneanditsinfluenceonrooting[J］．PlantCellRep，2001，20(6):517－524．［13］WILSONFM，JAMESDJ．Regenerationandtransformationofthepremi-erUKapple(Malus×pumilaMill．)cultivarQueenCox［J］．TheJournalofHorticulturalScienceandBiotechnology，2003，78:656－662．［14］KANAMARUN，ITOY，KOMORIS，etal．Transgenicappletransformedbysorbitol-6-phosphatedehydrogenasecDNA:Switchbetweensorbitolandsucrosesupplyduetoitsgeneexpression［J］．PlantSci，2004，167(1):55－61．［15］程家勝，鄂超蘇，田穎川等．轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因蘋果植株的再生［J］．中國(guó)果樹(shù)，1994(4):14－15．［16］WELANDERM，PAWLICKIN，HOLEFORSA，etal．Genetictransforma-tionoftheapplerootstockM26withtherolBgeneanditsinfluenceonrooting［J］．JournalofPlantPhysiology，1998，53:371－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