秈粳型轉(zhuǎn)基因水稻花粉源基因飄流特性比較研究

秈粳型轉(zhuǎn)基因水稻花粉源基因飄流特性比較研究

0基因飄流對(duì)水稻基因的影響[研究意義]食品和環(huán)境安全轉(zhuǎn)移已成為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)。水稻是中國(guó)的主要糧食。因此，水稻的研究、工業(yè)化及其環(huán)境安全、食品安全等成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，血液流動(dòng)的研究也成為熱點(diǎn)。在南方稻區(qū)生產(chǎn)應(yīng)用的水稻品種絕大多數(shù)為秈稻品種,在長(zhǎng)江中下游地區(qū)為秈、粳稻交錯(cuò)地區(qū),北方稻區(qū)則基本為粳稻品種,同等條件下對(duì)秈型和粳型轉(zhuǎn)基因水稻基因飄流進(jìn)行比較研究,有助于研究?jī)煞N類型花粉源基因飄流頻率的差異,也便于比較不同研究者有關(guān)基因飄流的研究結(jié)果,供管理部門在轉(zhuǎn)基因水稻釋放中進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,并為轉(zhuǎn)基因安全以及相關(guān)法規(guī)的制定提供參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】自1983年首例轉(zhuǎn)基因作物(GeneticallyModifiedCrops,GMC)問(wèn)世以來(lái),全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積和銷售收入均以倍數(shù)增長(zhǎng),盡管從1998年起國(guó)際上開(kāi)始了轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境和食品安全性的爭(zhēng)論,但由于利潤(rùn)可觀,轉(zhuǎn)基因作物依然在爭(zhēng)論中發(fā)展,2011年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)1.6億ha,比1996年增長(zhǎng)了94倍(James,2011)。通過(guò)基因工程手段獲得的轉(zhuǎn)基因水稻,以抗除草劑和抗病、蟲轉(zhuǎn)基因水稻為主。抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻是水稻基因工程中最早涉及且應(yīng)用最廣的一類,將抗除草劑基因?qū)胨臼蛊洚a(chǎn)生對(duì)除草劑的抗性,既利于控制直播稻田中的除草,也解決了雜交水稻制種純度的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題(朱冰等,1996;段發(fā)平等,2006)。目前,已經(jīng)獲得了抗草丁膦的bar基因和pat基因(Rathoreetal.,1993)及抗草甘膦的aroA基因等3類抗除草劑的轉(zhuǎn)基因水稻植株(CroughanandCroughan,1992)。在科技界和公眾關(guān)注的轉(zhuǎn)基因作物安全性問(wèn)題中,轉(zhuǎn)基因飄流及其可能引起的環(huán)境和食品潛在風(fēng)險(xiǎn)是熱點(diǎn)問(wèn)題之一。在自然界中大部分主要農(nóng)作物的栽培種和野生近緣種經(jīng)常出現(xiàn)基因飄流,而影響基因飄流的因素很多,如交配方式、授粉形式、種子散播途徑以及作物生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性等(Messeguer,2003)。由花粉擴(kuò)散介導(dǎo)的基因飄流的根本途徑是同物種間的受精結(jié)實(shí)和有性可交配物種間的異交結(jié)實(shí),因此花粉擴(kuò)散和基因飄流是一個(gè)歷來(lái)普遍存在的自然現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因作物如果不改變作物的開(kāi)花和生殖生物學(xué)特性,其基因飄流與非轉(zhuǎn)基因作物沒(méi)有本質(zhì)上的區(qū)別(賈士榮,2004)。目前,在轉(zhuǎn)基因水稻基因飄流研究中,所用的受體材料幾乎涉及現(xiàn)存的所有水稻品種類型,包括常規(guī)秈稻、粳稻,秈型和粳型不育系、秈型和粳型雜交水稻,普通野生稻及雜草稻等。在轉(zhuǎn)基因花粉供體方面,由于秈稻轉(zhuǎn)化效率明顯低于粳稻,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)直接獲得的抗除草劑秈稻恢復(fù)系不多,如明恢63(薛銳等,1998)和E32(王才林等,2004)等;而早期獲得的穩(wěn)定的抗除草劑轉(zhuǎn)基因株系材料大多是粳稻,如T京引119(朱冰等,1996)、T津稻162和T津稻18(施利利等,2004)。在供體花粉源的選擇方面,有些研究者使用粳型轉(zhuǎn)基因水稻。Messeguer等(2004)研究了粳型轉(zhuǎn)基因稻向紅稻和常規(guī)稻基因飄流;Jia等(2007)以粳型轉(zhuǎn)基因水稻L201為供體花粉源、以秈型雜交稻及不育系為花粉受體研究轉(zhuǎn)基因水稻的基因飄流。Yuan等(2007)則以粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2為花粉源、以秈型不育性博A為花粉受體,研究其不同方位的基因飄流情況。程林(2007)和余昌花(2011)研究了粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2向不同居群普通野生稻的基因飄流。另外部分研究者則采用秈型轉(zhuǎn)基因水稻為花粉源供體材料。戎俊等(2006)以秈稻品種明恢86恢復(fù)系及相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻,研究在相鄰種植的情況下由Bt/CpT轉(zhuǎn)基因水稻向?qū)?yīng)的非轉(zhuǎn)基因水稻品種的轉(zhuǎn)基因飄移。Xia等(2009)開(kāi)展了抗蟲轉(zhuǎn)基因秈稻與野生稻雜交后代正常表達(dá)及其生態(tài)生物安全的研究。Elena等(2009)利用秈型抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻,研究其向哥斯達(dá)黎加雜草稻的基因飄流及其影響因素?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,許多學(xué)者研究粳型轉(zhuǎn)基因水稻或秈型轉(zhuǎn)基因水稻向常規(guī)水稻及其稻屬植物的基因飄流,均相對(duì)獨(dú)立,以不同材料在不同地區(qū)開(kāi)展基因飄流試驗(yàn),研究結(jié)果有一定差異。而在同等條件下對(duì)秈型和粳型轉(zhuǎn)基因水稻基因飄流進(jìn)行比較研究,還未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在同等田間試驗(yàn)條件下,研究粳型轉(zhuǎn)基因水稻和秈型轉(zhuǎn)基因水稻分別向常規(guī)稻和水稻不育系的基因飄流,比較秈型和粳型轉(zhuǎn)基因花粉供體向受體常規(guī)稻、不育系的基因飄流頻率及其差異,為建立不同類型花粉供體基因飄流隨距離變化的數(shù)學(xué)模型提供參考。1材料和方法1.1抗病型水稻抗雜草基因及抗病系構(gòu)建平行的兩組試驗(yàn)分別采用粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2和秈型轉(zhuǎn)基因水稻Bar9311(簡(jiǎn)稱B9),作為為花粉供體。B2為含bar基因的抗Basta轉(zhuǎn)基因粳稻品種(OryzasativaL.cv.japonica),由中國(guó)水稻研究所利用基因槍法將bar基因?qū)氲匠Ｒ?guī)粳稻京引119中獲得轉(zhuǎn)bar基因粳稻植株T京引119(朱冰等,1996),通過(guò)6代自交篩選后其抗性基因已經(jīng)純合,農(nóng)藝性狀也基本穩(wěn)定(富昊偉等,2001)。B2是由T京引119植株與常規(guī)粳稻秀水63雜交獲得,歷經(jīng)14代的性狀分離,其抗除草劑bar基因基本穩(wěn)定(華志華等,2003)。B9為含bar基因抗除草劑的轉(zhuǎn)基因秈稻品系(OryzasativaL.cv.indica),該品系是由轉(zhuǎn)基因抗除草劑恢復(fù)系Bar68-l與9311經(jīng)過(guò)雜交并多次回交獲得的穩(wěn)定株系材料,Bar68-l是中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化方法將抗除草劑基因bar轉(zhuǎn)入早秈稻兩系恢復(fù)系D68中育成的轉(zhuǎn)基因抗除草劑恢復(fù)系。經(jīng)檢測(cè),它們具有抗除草劑特性并能穩(wěn)定遺傳(肖國(guó)櫻等,2007)?；ǚ凼荏w采用秈型水稻不育系博A(圖表中簡(jiǎn)稱BoA),為便于基因飄流頻率的計(jì)算,在種植不育系博A的同時(shí),種植常規(guī)稻特秈占25(圖表中簡(jiǎn)稱TXZ25),以作為競(jìng)爭(zhēng)花粉源;常規(guī)稻特秈占25同時(shí)還兼作轉(zhuǎn)基因花粉受體,計(jì)算不同類型(秈、粳稻)轉(zhuǎn)基因水稻分別向水稻不育系和常規(guī)稻的基因飄流頻率。1.2北—試驗(yàn)方法試驗(yàn)于2011年早季在海南省陵水縣新村鎮(zhèn)長(zhǎng)坡村進(jìn)行,該地田塊為東北—西南走向,北緯18°26′25.40″,東經(jīng)109°56′18.99″,海拔10m。該地夏季盛行東南風(fēng),將花粉源種植在受體正上風(fēng)方向,有利于轉(zhuǎn)基因水稻花粉向受體品種(系)的擴(kuò)散(飄流)。1.2.1試驗(yàn)地與試驗(yàn)材料秈型與粳型轉(zhuǎn)基因水稻花粉源向水稻不育系基因飄流分為兩組獨(dú)立試驗(yàn)并同時(shí)進(jìn)行,兩個(gè)試驗(yàn)相隔150m以上。轉(zhuǎn)基因花粉源位于上風(fēng)方向,受體位于花粉源下風(fēng)向。試驗(yàn)地均為長(zhǎng)方形,規(guī)格為32m×11m,其中轉(zhuǎn)基因花粉源32m×1m,受體區(qū)為32m×10m,不育系與常規(guī)稻按插植行比為不育系∶常規(guī)稻=3∶1相間種植。插秧方法同一般大田生產(chǎn),插秧秧齡25~30d,單苗插值,插植規(guī)格為17cm×23cm。田間試驗(yàn)布局見(jiàn)圖1。1.2.2田間措施試驗(yàn)根據(jù)前期不同材料預(yù)備試驗(yàn)確定的生育期,適時(shí)播種移栽,確保供試材料的花粉供體和受體之間的花期相遇。田間管理措施同當(dāng)?shù)卮筇?試驗(yàn)過(guò)程記錄不同材料的生育期,適時(shí)收獲取樣并隨機(jī)考察不同材料部分農(nóng)藝性狀。種植的受體材料按距離全部收割、混合,分成3份,計(jì)為3次重復(fù)。各材料生育期如表1。1.2.3調(diào)查和處理種子將收獲受體不育系博A和特秈占25的不同距離的種子,每個(gè)距離點(diǎn)每個(gè)重復(fù)取400g種子,視為一個(gè)樣品,每樣品約20000粒種子。設(shè)置B2和B9陽(yáng)性對(duì)照組,不育系博A和特秈粘25種子為陰性對(duì)照組。按照常規(guī)生產(chǎn)方法播種,使其正常出苗和生長(zhǎng),當(dāng)秧苗長(zhǎng)出第3片心葉時(shí),記錄其出苗總數(shù);三葉一心時(shí)噴施由拜耳作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)的除草劑Basta,每5d噴一次,濃度分別為500、500、800mg/L。噴藥3次后5d,記錄其存活的抗BastaR苗數(shù)(BastaR苗數(shù)),按照J(rèn)ia等(2007)的公式統(tǒng)計(jì),計(jì)算基因飄流頻率(%),計(jì)算公式如下:1.2.4pcr擴(kuò)增片段各處理隨機(jī)選取BastaR苗葉片,采用CTAB法(王關(guān)林和方宏筠,2002)提取總DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)假陽(yáng)性苗。PCR檢測(cè)引物為Bar-F(5′-GCACCATCGTCAACCACTAC-3′)和Bar-R(5′-GCCAGAAACCCACGTCAT-3′),PCR擴(kuò)增片段為400bp,PCR反應(yīng)體系:DNA模板0.5μL,10×Buffer(Mg2+)2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)1.0μL,上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL,Taq酶0.25μL,ddH2O19.0μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性3min;94℃1min,56℃1min,72℃1min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min,16℃保存。DNA分子標(biāo)記為Marker2000。2結(jié)果與分析2.1bar基因的穩(wěn)定性經(jīng)田間檢測(cè),噴施Basta后秧苗表現(xiàn)為兩類:一類為綠色正常生長(zhǎng)苗,不受噴施Basta除草劑的影響,正常生長(zhǎng),記為陽(yáng)性苗;另一類為黃色枯死苗,受噴施Basta除草劑的影響,全部死亡,沒(méi)有存活。在陽(yáng)性苗中,包括受體常規(guī)稻特秈占25和不育系博A,其中不育系博A的存活苗多于常規(guī)稻特秈占25。在陽(yáng)性對(duì)照組中,含bar基因的B2與B9秧苗區(qū),BastaR苗數(shù)均占100%;而在陰性對(duì)照中,不含bar基因的常規(guī)稻特秈占25和不育系博A的秧苗全部死亡,均無(wú)存活的BastaR苗。用轉(zhuǎn)bar基因水稻品種(品系)作為轉(zhuǎn)基因花粉源進(jìn)行基因飄流試驗(yàn),無(wú)論花粉源是秈型還是粳型,其不同受體在不同距離點(diǎn)上的收獲種子均有存活的抗BastaR苗,其抗BastaR苗的數(shù)量隨著受體離花粉源邊界距離的增加而減少。為檢驗(yàn)抗BastaR苗是否存在假陽(yáng)性,對(duì)噴藥后的存活苗取葉片進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明,抗BastaR苗均含有bar基因,不存在假陽(yáng)性苗(圖2)。2.2基因飄流頻率根據(jù)研究結(jié)果,粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2與秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向不育系博A基因的飄流頻率有一定差異,表現(xiàn)為在同一距離上兩者的基因飄流頻率差異極顯著(P<0.01),而在10m內(nèi)兩種類型花粉源的平均基因飄流頻率差異不顯著。當(dāng)距離為1m時(shí),粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2向不育系博A基因飄流頻率高達(dá)45.934%,秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向博A的基因飄流頻率為23.948%;當(dāng)距離為10m時(shí),粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2向不育系博A的基因飄流頻率低至3.906%,秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向博A的基因飄流頻率為1.325%。在0~10m的距離范圍內(nèi),粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2向博A的基因飄流頻率始終高于秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向博A的基因飄流頻率,兩者的飄流頻率隨距離的變化曲線不重疊、不交叉(圖3)。無(wú)論是秈型還是粳型轉(zhuǎn)基因水稻,向秈型不育系博A基因飄流頻率均隨距離的增加而減少,在3m內(nèi)的遞減明顯,而4m以后遞減趨于平緩。2.3距離和距離對(duì)水稻飄流頻率的影響通過(guò)對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2與秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向常規(guī)稻特秈占25的基因飄流頻率在同一距離上基因飄流頻率的差異不顯著(P>0.05),10m內(nèi)兩種類型花粉源的平均基因飄流頻率差異也不顯著(P>0.05),但在遠(yuǎn)距離和近距離表現(xiàn)均明顯不同(圖4)。當(dāng)距離為0m時(shí),秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向常規(guī)稻特秈占25基因飄流頻率為1.189%,粳型B2為0.435%;而當(dāng)距離為10m時(shí),粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2向特秈占25基因飄流頻率降低至0.041%,秈型為0.015%。由圖4可知,無(wú)論是秈型轉(zhuǎn)基因水稻還是粳型轉(zhuǎn)基因水稻,向秈型常規(guī)稻特秈占25基因飄流頻率均隨距離的增加而遞減,在2m內(nèi)的遞減明顯,在3m以后遞減趨于平緩。在6m內(nèi)的各個(gè)距離點(diǎn),粳型B2向特秈占25的基因飄流頻率始終低于秈型B9向特秈占25的基因飄流頻率,之后兩者出現(xiàn)交互現(xiàn)象。2.4兩種類型水稻基因飄流頻率的比較無(wú)論秈型還是粳型轉(zhuǎn)基因水稻,向不育系基因飄流的頻率遠(yuǎn)大于向常規(guī)稻的飄流頻率,粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2向不育系博A和常規(guī)稻特秈占25的基因飄流表現(xiàn)為在同一距離上二者差異極顯著(P<0.01),10m內(nèi)兩種類型花粉源的平均基因飄流頻率差異亦極顯著(P<0.01);秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向不育系博A和常規(guī)稻特秈占25的基因飄流表現(xiàn)為在同一距離上二者差異極顯著(P<0.01),10m內(nèi)兩種類型花粉源的平均基因飄流頻率差異不顯著(P>0.05),這可能與常規(guī)稻主要是自花授粉、較難接受外來(lái)花粉,而不育系自身無(wú)花粉、結(jié)實(shí)全部由異花授粉引起有關(guān)系。轉(zhuǎn)基因水稻向不育系及常規(guī)稻基因飄流頻率隨距離的增加而減少,漂流頻率—距離的變化曲線均符合乘冪曲線規(guī)律,若以x表示離花粉源邊界的距離(m),以y表示基因飄流頻率(%),則秈型轉(zhuǎn)基因水稻向不育系博A基因飄流規(guī)律隨距離的變化符合公式y(tǒng)=84.814x-1.6858,R2=0.976;向常規(guī)稻特秈占25的基因飄流隨距離的變化則符合公式y(tǒng)=1.278x-1.5502,R2=0.920;粳型轉(zhuǎn)基因水稻向不育系博A基因飄流規(guī)律趨勢(shì)符合公式y(tǒng)=106.305x-1.3891,R2=0.990;向常規(guī)稻特秈占25基因飄流規(guī)律趨勢(shì)符合公式y(tǒng)=0.248x-0.8360,R2=0.765。3基因飄流頻率本研究結(jié)果表明,粳型轉(zhuǎn)基因水稻B2與秈型轉(zhuǎn)基因水稻B9向常規(guī)稻特秈占25和不育系博A的基因飄流頻率差異較大,且在遠(yuǎn)距離和近距離表現(xiàn)明顯不同。當(dāng)距離為0m時(shí),秈、粳型轉(zhuǎn)基因水稻向常規(guī)稻特秈占25的基因飄流頻率均遠(yuǎn)高于同類型其他相應(yīng)距離的,而秈型轉(zhuǎn)基因稻B9向常規(guī)稻特秈占25的基因飄流頻率明顯高于粳型轉(zhuǎn)基因稻B2,主要是兩種秈稻間的花時(shí)基本相同,秈稻比粳稻花時(shí)早而且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),而秈、粳花時(shí)相遇時(shí)間較短(王開(kāi)錫等,1990)。在自然條件下,相同亞種類型的水稻花粉應(yīng)該更具親和性。在本研究中,10m試驗(yàn)區(qū)內(nèi)秈型轉(zhuǎn)基因水稻向不育系各點(diǎn)平均基因飄流頻率為1.325%~23.948%,粳型為3.906%~45.934%;而秈型轉(zhuǎn)基因水稻向常規(guī)稻各點(diǎn)平均基因飄流頻率為0.015%~1.189%,粳型為0.041%~0.435%。Jia等(2007)研究粳型轉(zhuǎn)基因水稻L201向不育系博A的最大基因飄流頻率為(36.116±2.683)%,向不育系中9A的飄流頻率則為(32.651±3.105)%。Messeguer等(2004)研究轉(zhuǎn)基因水稻向常規(guī)稻基因飄流頻率為(0.086±0.007)%。與前人的一些研究結(jié)果相比較,本研究獲得的基因飄流頻率有差異,但基因飄流隨著距離的變化趨勢(shì)基本一致,這可能與所用材料、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)區(qū)氣候條件差異有關(guān)。Yuan等(2007)研究轉(zhuǎn)基因水稻向不同方位的不育系基因飄流頻率,在下風(fēng)方向各距離點(diǎn)的基因飄流率均比本研究結(jié)果偏大,這可能與花粉源面積大小(即花粉源量)和風(fēng)向有關(guān)。Jia等(2007)以帶bar基因水稻品種為花粉供體,以常規(guī)稻、雜交水稻和不育系作為花粉受體研究了轉(zhuǎn)基因飄流規(guī)律,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因向不育系的飄流頻率較高,而向常規(guī)稻和雜交稻的飄流頻率較低,這是由于不育系無(wú)可育花粉、柱頭外露率高、異交結(jié)實(shí)性好、易于接受外來(lái)花粉造成的。水稻是自花授粉作物,異交率極低,而不育系為異交結(jié)實(shí),異交結(jié)實(shí)率極高。在本研究中,秈型轉(zhuǎn)基因稻B9向秈型水稻不育系博A基因飄流率低于粳型轉(zhuǎn)基因稻B2。據(jù)報(bào)道,轉(zhuǎn)基因稻B9盛花時(shí)間在9:30~11:30,而B2盛花時(shí)間主要集中在11:00~12:00(余昌花,2011);博A開(kāi)花時(shí)間則在9:00~14:00,高峰期在11:00~12:00(徐紀(jì)杰等,1993);雖然B9盛花時(shí)間較早且長(zhǎng),但開(kāi)花高峰期與不育系博A重疊時(shí)間較短,而且B9的散粉量較少,不利于授粉,而B