等吸收紫外光度法測定槐米提取物中的蘆丁和槲皮素

等吸收紫外光度法測定槐米提取物中的蘆丁和槲皮素

1蘆丁、槲皮素的測定蝗蟲是豆科植物的干燥花和花蕾?；泵子址Q槐花米,涼血止血,用于血熱所致的各種出血癥。尤宜于大腸火盛,溫?zé)嵊艚Y(jié)引起的便血、痔血等下部出血癥。本品因含有蘆丁和槲皮素等黃酮類生物活性物質(zhì),能降血壓及改善毛細(xì)血管的脆性,近年來,常用于高血壓癥的治療,是醫(yī)藥工業(yè)提取蘆丁的常用藥材。蘆丁是制備槲皮素的主要原料,具有多方面的生理活性,有保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性,調(diào)節(jié)毛細(xì)血管壁滲透性的作用。臨床上用于治療過敏性紫癜及各種因毛細(xì)血管脆性增加而引起的出血性疾病,也用于治療高血壓和老年氣管炎等。槲皮素用于治療慢性支氣管炎,對冠心病及高血壓也有輔助治療作用。同時(shí)具有明顯的抗腫瘤、抗氧化及影響各種酶的活性等作用。蘆丁和槲皮素的結(jié)構(gòu)及臨床上的作用很相似。兩種物質(zhì)往往共存,測定它們的含量時(shí),相互之間有干擾,需經(jīng)分離后才能進(jìn)行測定,操作繁瑣費(fèi)時(shí),誤差較大。槐米中蘆丁和槲皮素的測定,已有脈沖極譜法、高效液相色譜法、流動注射法、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測法和卡爾曼濾波法等。本法不經(jīng)分離,對槐米中的蘆丁和槲皮素同時(shí)進(jìn)行測定。其原理為:在等吸收波長處測定樣品溶液的吸光度,其吸光度差值ΔA只與其中一種組分的濃度呈線性關(guān)系,而與另一組分的濃度無關(guān)。本法簡便、快捷,精密度和準(zhǔn)確度亦令人滿意。2實(shí)驗(yàn)部分2.1主要試劑的配制751G分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);756MC分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);AB2004-N電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。槲皮素(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞衛(wèi)所,生化純),用電子天平準(zhǔn)確稱取槲皮素4.2mg,用甲醇溶解,移入50mL的容量瓶中,用甲醇定容至刻度,濃度為84μg/mL。蘆丁(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,生化純),用電子天平準(zhǔn)確稱取蘆丁4.3mg,用甲醇溶解,移入50mL的容量瓶中,用甲醇定容至刻度,濃度為86μg/mL;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。2.2評估蘆丁、槲皮素在13、34分別配制槲皮素(8.04μg/mL)和蘆丁(17.36μg/mL)的單組分標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定它們在波長240—380nm的吸光度,經(jīng)過粗選和細(xì)選,分別找出槲皮素和蘆丁的等吸收波長λ1、λ2、λ3、λ4。由于槲皮素在λ1、λ2處有相同的吸收,在此二波長處混合物的ΔA只與蘆丁的濃度有關(guān)。同理,在λ3、λ4處測定其吸光度,ΔA只與的槲皮素濃度有關(guān)。配制一系列濃度的槲皮素和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,在等吸收波長處測定其吸光度,計(jì)算吸光度的差值,作校準(zhǔn)曲線及線性回歸方程,由此可計(jì)算出未知物樣品中蘆丁和槲皮素的含量。3結(jié)果與討論3.1稀堿穩(wěn)定性的考察主要從蘆丁和槲皮素樣品的溶解度和穩(wěn)定性考慮,選擇稀堿(醋酸鈉、氫氧化鈉)水溶液、甲醇、不同比例的甲醇水溶液、乙醇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,樣品不溶于醋酸鈉溶液,稀氫氧化鈉對待測物質(zhì)的穩(wěn)定性影響較大,很短時(shí)間就使蘆丁、槲皮素溶液由黃色變?yōu)樽攸S色。樣品均能很好地溶于甲醇,蘆丁在1∶4的甲醇水溶液中穩(wěn)定性最好(約放置3h吸光度不會有大的變化)。槲皮素在1∶4的甲醇水溶液中能穩(wěn)定1h,符合測定要求。樣品在乙醇中溶解時(shí)需水浴加熱,但在加熱時(shí),蘆丁少部分發(fā)生水解,生成槲皮素和糖。本實(shí)驗(yàn)用甲醇溶解并配制樣品,用1∶4的甲醇水溶液作為稀釋液。3.2紫外分光光度計(jì)檢測移取一定體積的蘆丁和槲皮素儲備液,經(jīng)1∶4的甲醇水溶液稀釋后,配制成蘆丁8.04μg/mL、槲皮素17.36μg/mL的單組分標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描測定,繪制相應(yīng)的吸收曲線,同時(shí)確定槲皮素在波長247nm和266nm有相同的吸收,蘆丁在波長340nm和370nm處有相同的吸收。具體情況如圖1所示。3.3校準(zhǔn)曲線測定配制一系列濃度的蘆丁溶液,測定其在波長247nm和266nm的吸光度,計(jì)算其對應(yīng)的吸光度差值,作出ΔA—C校準(zhǔn)曲線。結(jié)果列于表1。校準(zhǔn)曲線回歸方程:ΔA=0.0147C+0.0058;相關(guān)系數(shù)r=0.9996。配制一系列濃度的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液,在波長340nm和370nm處測定其吸光度,計(jì)算相應(yīng)的吸光度差值,結(jié)果列于表2。校準(zhǔn)曲線回歸方程:ΔA=0.0679C+0.0327,相關(guān)系數(shù)r=0.9993。3.4蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)使用液移取2mL樣品儲備液,用1∶4的甲醇水溶液稀釋至10mL,計(jì)算得到此溶液中含蘆丁14.88μg/mL,槲皮素1.742μg/mL。在該溶液中加入不同比例的蘆丁和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定后計(jì)算其回收率。結(jié)果列于表3。3.5蘆丁含量測定結(jié)果稱取50g槐米(本市藥店所購)用蒸餾水浸泡10h后,用70%乙醇回流提取3次,過濾合并濾液,蒸餾回收乙醇,濃縮干燥得提取物。稱取4.6mg提取物,用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中,用1∶4的甲醇水溶液定容至刻度,制得樣品儲備液。移取2.0mL—4.5mL(間隔0.5mL)的樣品儲備液,配制成一系列濃度的樣品溶液,在波長247nm和266nm下測定其吸光度值,并計(jì)算吸光度差值,用ΔA=0.0147C+0.0058計(jì)算蘆丁的濃度,進(jìn)而可以計(jì)算出樣品中蘆丁的含量。結(jié)果列于表4。移取2.0mL—4.5mL(間隔0.5mL)的樣品儲備液,配制成一系列濃度的樣品溶液,在波長340nm和370nm下測定其吸光度值,并計(jì)算吸光度差值,用ΔA=0.0679C+0.0327計(jì)算槲皮素的濃度,進(jìn)而可以計(jì)算出樣品中槲皮素的含量。結(jié)果列于表5。4組分同