陽離子交換樹脂分離和富集蓮子里黃酮類與生物堿類物質(zhì)的研究

陽離子交換樹脂分離和富集蓮子里黃酮類與生物堿類物質(zhì)的研究

采用現(xiàn)代分離純度技術(shù)對植物中的不同有效成分組進(jìn)行分離，然后進(jìn)行藥物篩選和試驗。這是合理利用藥物資源開發(fā)西藥的重要手段之一。蓮子心(PlumulaNelumubinis)為睡蓮科蓮屬植物蓮(NelumbonuciferaGaertn.)成熟種子中的綠色幼葉及胚根,是一種常用藥材。蓮子心中含有生物堿類、黃酮類等多種活性物質(zhì)。生物堿類具有降血壓、抗心律失常、抗血小板聚集、降血糖、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、抗氧化等藥理活性;黃酮類物質(zhì)主要為木樨草素、蘆丁、金絲桃苷等,其具有抗氧化、清除自由基、抑制腫瘤細(xì)胞等藥理作用。以往對蓮子心的研究主要集中在生物堿類物質(zhì)的提取分離純化及藥理活性,而對蓮子心黃酮類物質(zhì)的研究較少,未能將蓮子心資源充分利用。因此,通過適當(dāng)?shù)姆蛛x方法對蓮子心生物堿及黃酮類成分進(jìn)行分離富集是非常有必要的。在充分分析蓮子心生物堿類及黃酮類的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)后,本文探討了離子交換樹脂用于蓮子心生物堿和黃酮類物質(zhì)分離富集的工藝條件。1a柱溫箱、g3235a電極質(zhì)譜檢測Agilent1100高效液相色譜儀,包括G1311A四元梯度泵、G1313A自動進(jìn)樣器、G1311A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器(安捷倫科技有限公司);甲基蓮心堿對照品(自制,歸一化法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97%);蓮心堿對照品(自制,歸一化法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%);異蓮心堿對照品(自制,歸一化法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%);蓮心黃酮Ⅳ對照品(自制,歸一化法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%);蓮子心提取液(制備方法見文獻(xiàn))。2方法和結(jié)果2.1條件12.1.1流動相0.1%三乙胺-3-甲基苯磺酸酯b-3-甲基苯磺酸酯b的合成色譜柱為HypersilBDSC18柱(4.6mm×150mm,5μm),流動相為甲醇(B)-水(0.1%三乙胺)(A),梯度洗脫:0～5min,60%～75%B;5～10min,75%～80%B。檢測波長282nm,流速1.0mL/min,柱溫30℃。2.1.2冰醋酸溶液a的制備色譜柱為XB-C18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇(B)-0.2%冰醋酸溶液(A),梯度洗脫:0～40min,30%～35%B;40～55min,35%～35%B。進(jìn)樣量20μL,流速0.8mL/min,檢測波長340nm,柱溫25℃。2.2上分層浸泡法分別將001×1、001×7、001CC、D152四種陽離子交換樹脂加2倍樹脂體積的飽和食鹽水浸泡24h,然后放盡食鹽水,用清水漂洗干凈,使排出水不帶黃色,攪動排出氣泡,裝入層析柱中。用3～4BV4%NaOH沖柱,浸泡2h后放盡堿液,純化水洗至近中性;用3～4BV5%HCl沖柱,浸泡4h后放盡酸液,純化水洗至近中性,備用。2.3蓮心堿含量測定以蓮心黃酮Ⅳ和甲基蓮心堿靜態(tài)比吸附量及解析率為指標(biāo),對001×1、001×7、001CC、D152四種陽離子交換樹脂進(jìn)行考察。準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂(濕樹脂)5g各兩份,置于具塞三角瓶中,準(zhǔn)確加入經(jīng)澄清劑處理的蓮子心提取液100mL(藥液比1∶10),靜態(tài)吸附4h;用純水洗至洗脫液無色,抽干殘留的溶液,放入具塞三角瓶中,準(zhǔn)確加入70%乙醇50mL,解析4h,測定濾液中蓮心黃酮Ⅳ含量;再準(zhǔn)確加入NaCl飽和的70%乙醇溶液50mL,解析4h,測定濾液中甲基蓮心堿含量;計算比吸附量及解析率,結(jié)果見表1。由以上結(jié)果可知,D152離子交換樹脂對蓮心黃酮Ⅳ和Nef的吸附量和解析率均較大。2.4靜態(tài)吸附動力學(xué)選擇合適的樹脂,除了需具有較大的吸附容量、吸附率和解析率外,還要有較快的吸附速率,僅僅以樹脂的靜態(tài)吸附率來評價其吸附性是不全面的。本實驗對吸附率和解吸率均較好的D152樹脂進(jìn)行吸附動力學(xué)試驗,繪制樹脂的靜態(tài)動力學(xué)曲線。取樹脂5g,置于具塞磨口三角瓶中,精密加入蓮子心提取液(藥液比為1∶10)100mL,每隔10min振搖1次,持續(xù)4h,分別于10、20、30、40、50、60、90、120、180、240min各取1mL,測定其甲基蓮心堿及蓮心黃酮Ⅳ含量,繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線,如圖1所示。D152樹脂對蓮心黃酮N的吸附在3h內(nèi)基本達(dá)平衡,起始階段的吸附量較大,大約需2h,到2h后吸附量較平緩;D152樹脂對Nef的吸附為快速平衡型,在3h內(nèi)達(dá)平衡,起始階段大約需1h,吸附量較大,第Ⅱ階段為慢速吸附過程,到2h后,吸附量變化平緩。故在實際應(yīng)用中,綜合考慮生產(chǎn)周期,上柱液吸附2h即可。2.5最大上樣體積的確定稱取20.00g(約30mL)已處理好的樹脂,純化水濕法裝柱(直徑16mm,高150mm),吸取蓮子心提取液(1∶6)上柱,流速為2BV/h,分段收集流出液,每30mL(1BV)收集1份,共收集20份。測定流出液中蓮心黃酮Ⅳ和甲基蓮心堿含量,當(dāng)流出液中檢測到蓮心黃酮Ⅳ和甲基蓮心堿時表明樹脂開始穿透,從而確定最大上樣體積,結(jié)果見圖2。由圖2可知,上樣量為5BV時流出液中開始檢測到蓮心黃酮Ⅳ,但5～8BV時穿透量較少,從9BV開始穿透量增大;上樣量為11BV時流出液中開始檢測到Nef,但11、12BV時穿透量較少,從13BV開始穿透量增大。綜合二者考慮,上樣量為8BV較適宜。2.6溫度對蓮心黃酮和甲基蓮心堿含量的影響稱取20.00g(約30mL)已處理好的樹脂,純化水濕法裝柱(直徑16mm,高150mm),精密吸取250mL蓮子心提取液(1∶6)上柱,控制不同流速(1、2、3、4、5BV/h)進(jìn)行吸附,再用純水5BV洗至色淡,合并過柱液及水洗液,濃縮至一定體積,測定其中蓮心黃酮Ⅳ及甲基蓮心堿含量,計算比吸附量,從而確定最佳吸附流速,結(jié)果如圖3所示,吸附流速為2BV/h時蓮心黃酮Ⅳ及甲基蓮心堿比吸附量較大。2.7洗脫溶劑濃度對黃酮類物質(zhì)洗脫的影響稱取20.00g(約30mL)已處理好的樹脂,純化水濕法裝柱(直徑16mm,高150mm),根據(jù)已確定的最佳動態(tài)吸附條件進(jìn)行吸附。純化水洗至色淡,然后用10%、30%、50%、70%、95%的乙醇各5BV上柱洗脫,流速控制為2BV/h,每30mL(即1BV)收集1份,測定蓮心黃酮Ⅳ的含量,繪制洗脫曲線。將解析完黃酮類物質(zhì)的樹脂,依次用0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g/mLNaCl-70%乙醇溶液(NaClg/70%乙醇體積mL)各5BV洗脫,流速控制為2BV/h,每30mL(即1BV)收集1份,測定甲基蓮心堿的含量,繪制洗脫曲線,結(jié)果見圖4。由圖4可知,10%、30%、50%、70%均能將黃酮類物質(zhì)洗脫下來,且主要集中在30%～50%的乙醇洗脫液中,但用50%乙醇溶液不能完全洗脫下黃酮類物質(zhì),70%乙醇洗脫液能把剩余的黃酮洗脫完,繼續(xù)加入高濃度的乙醇洗脫液黃酮含量無明顯變化。故選擇洗脫能力較強(qiáng)的70%乙醇為黃酮類物質(zhì)的洗脫溶媒。洗脫方法為先用蒸餾水約5BV洗脫水溶性雜質(zhì)至流出液色淡,再用70%乙醇洗脫黃酮。0.01g/mLNaCl-70%乙醇溶液洗脫的Nef超過洗脫總量的70%,0.02g/mLNaCl-70%乙醇溶液洗脫的Nef約為洗脫總量的20%,0.03g/mLNaCl-70%乙醇溶液可將剩余部分Nef全部洗脫?？紤]成本、生產(chǎn)周期,以及后續(xù)需除去NaCl,故選擇0.02g/mLNaCl-70%乙醇溶液作為生物堿洗脫劑。2.8洗脫溶劑用量稱取20.00g(約30mL)已處理好的樹脂,純化水濕法裝柱(直徑16mm,高150mm),根據(jù)已確定的最佳動態(tài)吸附條件進(jìn)行吸附,純化水洗至無色,然后依次用70%乙醇及0.02g/mLNaCl-70%乙醇溶液各10BV上柱洗脫,流速控制為2BV/h,每30mL(即1BV)收集一份,測定蓮心黃酮Ⅳ及甲基蓮心堿含量,繪制洗脫曲線,見圖5。由圖5可知,8BV70%乙醇可將大部分黃酮洗脫,洗脫劑用量為10BV時黃酮洗脫完全?？紤]本實驗?zāi)康臑榉蛛x生物堿與黃酮,所以應(yīng)黃酮盡量洗脫完全,故黃酮類物質(zhì)最佳洗脫溶媒用量定為10BV較適宜。當(dāng)洗脫體積從2BV增至4、5、6、7BV時,Nef總含量增加分別為2BV的193.8%、220.0%、241.5%,255.1%,而從2BV增至8、9BV時,Nef總含量增加為2BV的263.5%、265.2%,與洗脫體積為7BV時相差不大,考慮到生產(chǎn)成本及周期問題,生物堿洗脫劑用量選擇7BV較適宜。2.9洗脫溫度的確定平行裝5支樹脂柱,按最佳吸附條件,吸取上樣液(8BV)上柱吸附,先純化水洗至色淡,用相同體積的同一洗脫液按不同流速洗脫(先用10BVmL70%乙醇洗脫,再用7BVNaCl-70%乙醇洗脫),分別控制流速為1、2、3、4、5BV/h。洗脫流速對洗脫率的影響結(jié)果見圖6,由圖6可知,洗脫流速為2BV/h時蓮心黃酮Ⅳ及Nef的洗脫率最高。2.10生物洗脫劑的鹽處理參考文獻(xiàn)方法,將生物堿洗脫部分水浴蒸干后,殘渣用煮沸的甲醇溶解,混合溶液在冰箱中4℃靜置數(shù)小時,過濾,回收甲醇,得生物堿。2.11蓮子體內(nèi)黃酮和原則根據(jù)實驗優(yōu)選的最佳吸附-洗脫條件,稱取20.00g(約30mL)已處理好的樹脂,純化水濕法裝柱(直徑16mm,高150mm),分別吸取藥液比為1∶6的蓮子心提取液240mL上柱,依次用5BV純化水洗去雜質(zhì),10BV70%乙醇洗脫黃酮類物質(zhì),7BV0.02g/mLNaCl-70%乙醇洗脫生物堿,流速為2BV/h,平行3份進(jìn)行試驗,以蓮心黃酮Ⅳ和Nef為指標(biāo),計算精制度及洗脫率,結(jié)果如表2所示,純化后黃酮和生物堿純度大大提高,精制倍數(shù)可分別達(dá)27.08倍及7.86倍,洗脫率分別為84.28%及88.84%。表明用D152陽離子交換樹脂分離富集蓮子心中黃酮和生物堿的工藝較為穩(wěn)定可靠,且分離富集效果顯著。將所得的黃酮類物質(zhì)按“2.1.2”項下方法進(jìn)行HPLC分析,色譜圖見圖7,從其DAD光譜圖可知,這些化合物符合黃酮類物質(zhì)紫外特征。生物堿產(chǎn)品的HPLC圖見圖8,從圖中可知,該部分主要為3個化合物,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品確認(rèn)圖中1、2、3分別為蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿。說明該工藝能同時分離和富集蓮子心中黃酮和生物堿類物質(zhì)。3討論3.1陽離子交換樹脂的分離效果預(yù)實驗考察了多種型號的陽離子交換樹脂對蓮子心黃酮及生物堿類物質(zhì)的同步分離效果,其中,001×1、001×7、001CC、D152四種陽離子交換樹脂對黃酮和生物堿的分離效果較好;通過靜態(tài)吸附-解析、靜態(tài)動力學(xué)實驗考察,選擇了對蓮子心中黃酮和生物堿類物質(zhì)的同步分離