淹水過(guò)程中甜櫻桃兩種木根的酶活性變化

淹水過(guò)程中甜櫻桃兩種木根的酶活性變化

杏仁是多種養(yǎng)分和菲涅耳的一種豐富而有效的樹(shù)種之一。雖然它是近年來(lái)快速發(fā)展的樹(shù)種之一，但其生產(chǎn)中的櫻桃顯示出不適應(yīng)洪水。2001年和2003年，由于大量降雨，煙臺(tái)地區(qū)的大型甜櫻桃受害者，一些果園的受害者。因此，洪水是阻礙甜櫻桃發(fā)展的重要因素之一。低氧環(huán)境中的植物根系,需要糖酵解提供能量,誘導(dǎo)產(chǎn)生了許多參與無(wú)氧呼吸的酶,包括PDC、ADH和LDH等,并產(chǎn)生許多糖酵解末端產(chǎn)物,如乙醛、乙醇、乳酸、丙氨酸等。其中乙醛、乙醇是乙醇發(fā)酵途徑中PDC、ADH的催化產(chǎn)物,乳酸是LDH的催化產(chǎn)物。有研究認(rèn)為乙醇、乙醛積累是造成細(xì)胞傷害的主要原因,而乳酸積累引起細(xì)胞pH急降造成細(xì)胞質(zhì)酸化也被認(rèn)為是造成細(xì)胞傷害的另一主要原因。目前國(guó)外在缺氧脅迫下植株發(fā)酵活性和光合能力及擬南芥中乙醇發(fā)酵途徑酶基因誘導(dǎo)方面有所研究。但對(duì)淹水條件下不同類型砧木根系無(wú)氧呼吸酶及發(fā)酵產(chǎn)物變化比較研究未見(jiàn)報(bào)道,本研究選用生產(chǎn)上常用且抗?jié)承杂胁町惖奶饳烟艺枘?東北山櫻桃和馬哈利(嫁接品種為美早)為試材,擬比較分析導(dǎo)致兩種砧木對(duì)淹水敏感性差異的可能原因,為生產(chǎn)上砧木選擇提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1泥瓦盆栽植處理將1年生美早/東北山櫻桃(PrunusserrulataG.Don)(T1)和美早/馬哈利(PrunusmahalebL.)(T2)甜櫻桃植株于2006年3月定植于上口徑25cm,下口徑22cm,深20cm的泥瓦盆中。土壤類型為壤土,每盆一株,正常管理,并于2006年8月7日在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)根系研究室作如下處理:選取長(zhǎng)勢(shì)一致的盆栽美早/東北山櫻桃和美早/馬哈利淹入水中,淹水在自然條件下進(jìn)行,采用“雙套盆法”,將種植植株的泥瓦盆置于直徑為30cm,深28cm的塑料桶內(nèi),保持水層高于盆土表面2cm左右。取樣時(shí)每2株為一單位,3次重復(fù),分別在淹水0、24、48、72、96、120h時(shí)取樣測(cè)定。1.1.1粗酶液的提取選取長(zhǎng)3～5cm、直徑1.5mm左右的生長(zhǎng)根、褐色木質(zhì)根,各稱取0.5g左右,放入預(yù)冷研缽中,再加入預(yù)冷的酶提取液:50mmol·L-1Tris-HCl(pH6.8),內(nèi)含5mmol·L-1MgCl2、5mmol·L-1β-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)為15%甘油、1mmol·L-1EDTA、1mmol·L-1EGTA和0.1mmol·L-1苯甲基磺酰氟,冰浴研磨后,于4℃12000×g離心20min提取粗酶液。1.1.2表面活性劑的啟動(dòng)反應(yīng)用日本島津UV-2450紫外分光光度計(jì),測(cè)定PDC、ADH和LDH在340nm處吸光值變化。丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測(cè)定:反應(yīng)混合液為50mmol·L-1MES(pH6.8),含25mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1MgCl2、0.5mmol·L-1TPP、2mmol·L-1DTT、0.17mmol·L-1NADH、50mmol·L-1草氨酸鈉、10UADH,用10mmol·L-1丙酮酸啟動(dòng)反應(yīng)。乙醇脫氫酶(ADH)活性測(cè)定:反應(yīng)混合液為50mmol·L-1TES(pH7.5),含2.5μmol·L-1NADH,用0.125mmol·L-1乙醛啟動(dòng)反應(yīng)。乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定:反應(yīng)混合液為0.1mol·L-1磷酸(pH7.0),含4μmol·L-1NADH、0.24mmol·L-1丙酮酸,用酶提取液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。1.1.3加磨機(jī)研磨法參照田世平方法,選取長(zhǎng)3～5cm、直徑1.5mm左右的根系,稱取1g,用1ml濃度為20%TCA冰浴研磨,樣品研碎后置于青霉素小瓶中,加蓋密封。測(cè)定時(shí),先將樣品放在45℃的熱水浴中1h,用注射器在瓶頂部抽取0.5ml的氣樣,用裝有FID的日本島津ShimadzuGC-9A型氣相色譜儀測(cè)定乙醛、乙醇含量,色譜柱溫100℃,檢測(cè)溫200℃,載氣N2和H2流速為30ml·min-1,樣品濃度采用外標(biāo)法計(jì)算。1.1.4u3000專有液的制備參照趙尊行方法,選取長(zhǎng)3～5cm、直徑1.5mm左右的褐色木質(zhì)根,稱取3g左右,用20ml80%酒精研碎,轉(zhuǎn)移至50ml離心管中,于75℃下浸提25min,然后4000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清夜至50ml容量瓶中,之后同樣條件分兩次用15ml80%酒精洗殘?jiān)?再離心收集上清夜,合并,定容至50ml。搖勻后取6ml蒸干,殘?jiān)?ml流動(dòng)相溶解后,經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后移入1.5ml離心管中保存供色譜分析用。采用美國(guó)Waters510型高效液相色譜儀測(cè)定乳酸含量,測(cè)定條件:波長(zhǎng)210nm,色譜柱為ODSC18反相柱,檢測(cè)器Waters2487,用過(guò)0.22μm膜pH2.55重蒸水配制的18mmol/LKH2PO4溶液作流動(dòng)相,流速0.8ml/min,柱溫為30℃,進(jìn)樣量10μl,采用外標(biāo)法計(jì)算乳酸含量。試驗(yàn)結(jié)果均采用SAS軟件Duncan多重比較法(P<0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1浸泡水對(duì)挑選甜櫻桃根系的無(wú)聲呼吸酶pdc、adh和ldh的影響2.1.1．3雨水過(guò)程中葉片pdc活性的變化圖1A顯示,淹水前T1生長(zhǎng)根PDC活性高于T2。淹水過(guò)程中T1、T2PDC活性先升后降,二者PDC活性在淹水48h時(shí)均達(dá)最大值,其中T1為0.381μmol·mg-1protein·min-1,T2為0.889μmol·mg-1protein·min-1。最終T2PDC活性比淹水前增加76%,T1PDC活性比淹水前增加24%,T2PDC活性增幅大于T1。T1、T2褐色木質(zhì)根PDC活性與生長(zhǎng)根PDC活性整體變化趨勢(shì)基本一致,即淹水過(guò)程中該酶活性先升后降(圖1B)。淹水24h時(shí)T2PDC活性達(dá)最大值為0.160μmol·g-1FW·min-1,而T1PDC活性淹水48h達(dá)最大值0.142μmol·g-1FW·min-1。最終T1褐色木質(zhì)根PDC活性為淹水前的2.39倍而T2PDC活性為淹水前的3.17倍。比較圖1A和圖1B,淹水過(guò)程中,生長(zhǎng)根PDC活性變化幅度大于褐色木質(zhì)根。2.1.2t1、t1dh活性淹水過(guò)程中生長(zhǎng)根ADH活性變化均表現(xiàn)為先升后降(圖2A),一經(jīng)淹水兩種砧木生長(zhǎng)根ADH活性逐漸升高,至72h時(shí)二者ADH活性同時(shí)達(dá)最大值,分別為2.725μmol·g-1FW·min-1和3.986μmol·g-1FW·min-1,之后其活性開(kāi)始下降,至96h時(shí),T1ADH活性為淹水前的1.75倍,T2為淹水前的1.49倍。圖中還可看出,T2生長(zhǎng)根ADH活性均顯著高于T1,但T1ADH活性增加幅度大于T2。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),T1、T2褐色木質(zhì)根ADH活性呈上升趨勢(shì)(圖2B),淹水至120h時(shí),T1ADH活性為1.186μmol·g-1FW·min-1,是淹水前的3.69倍,T2為1.684μmol·g-1FW·min-1,是淹水前的2.56倍,ADH活性增加幅度表現(xiàn)為T1>T2,與生長(zhǎng)根一致。比較圖2A、B,生長(zhǎng)根在淹水96h時(shí)ADH活性與淹水前相比已處于較低水平,而褐色木質(zhì)根ADH活性在120h時(shí)仍未出現(xiàn)下降趨勢(shì),維持較高水平。2.1.3t1ldh活性生長(zhǎng)根LDH活性先升后降,其變化如圖3A所示。T1、T2淹水24h時(shí)生長(zhǎng)根LDH活性即達(dá)峰值,分別為0.192μmol·mg-1protein·min-1和0.163μmol·mg-1protein·min-1,之后該酶活性急劇下降,淹水前48h,T1LDH活性高于T2并達(dá)顯著性差異,至96h時(shí),T1為淹水前的115%,T2為淹水前的107%。淹水過(guò)程中褐色木質(zhì)根LDH活性變化與生長(zhǎng)根趨勢(shì)基本一致,即先升高后降低(圖3B),但T1比T2出現(xiàn)峰值較早。比較兩類根發(fā)現(xiàn),淹水過(guò)程中褐色木質(zhì)根LDH活性低于生長(zhǎng)根,且褐色木質(zhì)根LDH活性達(dá)峰值時(shí)間滯后于生長(zhǎng)根。2.2浸泡水對(duì)培育甜櫻桃中的乙醇、乙醇和脂肪酸含量的影響2.2.1情況1:未培養(yǎng)成分配的乙醛含量隨淹水時(shí)間延長(zhǎng)乙醛含量呈上升趨勢(shì)(圖4),且表現(xiàn)為T2乙醛含量高于T1(96h除外)。T1乙醛含量在淹水96h時(shí)后有所下降,淹水至120h時(shí)乙醛含量是初始值的167倍。T2乙醛含量淹水24h內(nèi)即迅速升高,之后升高趨勢(shì)變緩,至120h時(shí)T2乙醛含量為88.36μmol·g-1FW,是T1的1.18倍,比T1積累更多乙醛。2.2.2adh活性測(cè)定由圖5可以看出,淹水過(guò)程中T1、T2根系中乙醇含量均呈上升趨勢(shì),這與淹水過(guò)程中ADH活性變化一致(圖2B)且T1乙醇含量高于T2。在淹水前96h,乙醇含量變化相對(duì)較小,之后T1、T2乙醇含量驟升并達(dá)顯著性差異,淹水120h時(shí)表現(xiàn)為T1乙醇含量高于T2。2.2.3其他乳酸含量T1乳酸含量在淹水初期即迅速增加,至48h時(shí)達(dá)最大值0.44μg·g-1FW,為初始值的4.89倍,是同期T2的6.29倍,之后乳酸含量急劇下降,淹水120h時(shí)基本恢復(fù)到初始值水平(圖6)。淹水0～72h內(nèi)T2乳酸含量變化不大,至96h時(shí)達(dá)最大值0.20μg·g-1FW。由圖6還可以看出,淹水前48hT1乳酸含量遠(yuǎn)高于T2,72h后T2乳酸含量開(kāi)始大于T1。3大力推進(jìn)期e活性變化低氧脅迫下的植物根系,其糖酵解代謝產(chǎn)物丙酮酸通過(guò)三羧酸循環(huán)(TCA)途徑產(chǎn)生ATP和NAD+的能力嚴(yán)重削弱。相反地,植物為了產(chǎn)生足夠的ATP和NAD+維持細(xì)胞功能運(yùn)轉(zhuǎn),無(wú)氧發(fā)酵途徑作為一種短期適應(yīng)方式出現(xiàn)。低氧條件下植物根系中的丙酮酸在許多無(wú)氧呼吸酶催化作用下,分別進(jìn)入乙醇發(fā)酵途徑、乳酸發(fā)酵途徑等,繼而產(chǎn)生乙醛、乙醇和乳酸等發(fā)酵產(chǎn)物,這些產(chǎn)物被認(rèn)為是造成細(xì)胞受害的主要原因。本研究結(jié)果顯示,淹水過(guò)程中不同甜櫻桃砧木的兩種根系類型中的無(wú)氧呼吸酶活性均發(fā)生顯著變化,其褐色木質(zhì)根無(wú)氧呼吸酶催化產(chǎn)物乙醛、乙醇含量均明顯增加,兩砧木褐色木質(zhì)根中乳酸含量峰值出現(xiàn)在不同淹水時(shí)間段內(nèi),且遠(yuǎn)高于其初始值,表明無(wú)氧呼吸酶活性變化是植物根系響應(yīng)淹水條件下能量匱乏的一種積極機(jī)制,而其催化的不同潛在有害終產(chǎn)物含量增加的差異則對(duì)細(xì)胞造成不同程度的傷害,酸性物質(zhì)含量增加的時(shí)間和量的差異引起細(xì)胞質(zhì)酸中毒程度不同,導(dǎo)致兩種砧木對(duì)淹水的敏感性不同。PDC作為乙醇發(fā)酵途徑中催化丙酮酸生成乙醛的關(guān)鍵酶,前人報(bào)道低氧條件下植物根系中PDC活性升高。本研究結(jié)果表明,甜櫻桃根系淹水過(guò)程中PDC活性及其催化發(fā)酵產(chǎn)物乙醛含量變化具有階段性,即一經(jīng)淹水,生長(zhǎng)根PDC活性明顯升高,這與前人研究結(jié)果一致,隨淹水時(shí)間延長(zhǎng),該酶活性逐漸下降且淹水過(guò)程中T2PDC活性增幅大于T1,表明生長(zhǎng)根細(xì)胞受害較重,酶活性受到影響,整個(gè)淹水期間T2生長(zhǎng)根中乙醛含量可能積累較多。褐色木質(zhì)根PDC活性變化與生長(zhǎng)根PDC活性變化趨勢(shì)基本一致,但褐色木質(zhì)根PDC活性變化幅度明顯小于生長(zhǎng)根,表明淹水過(guò)程中生長(zhǎng)根PDC活性變化較褐色木質(zhì)根相對(duì)劇烈,淹水至120h時(shí)已檢測(cè)不到生長(zhǎng)根PDC活性而褐色木質(zhì)根PDC活性仍高于淹水前,進(jìn)一步表明褐色木質(zhì)根作為維持樹(shù)體功能的器官受淹水影響的程度小于生長(zhǎng)根。Perata和Alpi認(rèn)為在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,添加外源乙醇引起的毒害效果是由于乙醛的形成。對(duì)褐色木質(zhì)根中乙醛含量測(cè)定表明,低氧條件下乙醛含量均明顯升高,T1乙醛含量在96h達(dá)峰值后下降,這與T1褐色木質(zhì)根ADH活性增加幅度大體吻合,即更多乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇,導(dǎo)致T1褐色木質(zhì)根中乙醇積累較多,而T2褐色木質(zhì)根PDC活性增幅大于T1且最終T2乙醛含量高于T1,認(rèn)為乙醛含量積累的更多是T2受害的原因之一,與Perata和Alpi的研究結(jié)果一致。SuandLin對(duì)淹水的絲瓜根系研究認(rèn)為,乙醛濃度并不與PDC活性的誘導(dǎo)成比例,乙醛濃度5d后才輕微增加,本研究結(jié)果證實(shí)了這一觀點(diǎn),即淹水后褐色木質(zhì)根乙醛含量升高與PDC活性升高并非一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,PDC活性出現(xiàn)峰值時(shí)間較早,乙醛含量達(dá)峰值時(shí)間相對(duì)延遲,但乙醛含量升高與PDC活性升高(與初始值相比)的總趨勢(shì)在淹水期間內(nèi)呈時(shí)間段對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖4、圖1B)。乙醇發(fā)酵途徑研究較多,該途徑中ADH是研究的重點(diǎn)。已有研究表明,淹水明顯促進(jìn)玉米根系A(chǔ)DH活性,不耐澇品種活性的增幅高于耐澇品種。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)根和褐色木質(zhì)根ADH活性均高于初始值,表明淹水促進(jìn)了甜櫻桃根系A(chǔ)DH活性的升高。T1兩類根系A(chǔ)DH活性增加幅度均大于T2,表明T1比T2對(duì)淹水更敏感。Crawford和Baines認(rèn)為許多植物有代謝乙醇的能力,在淹水和非淹水樹(shù)的根和干中都可檢測(cè)到乙醇,Nilsen和Orcutt認(rèn)為根能耐淹水而不會(huì)死亡,必須把乙醇維持在可忍耐的水平,且能產(chǎn)生足夠的ATP維持細(xì)胞的功能,Barclay和Crawford認(rèn)為豌豆幼苗缺氧條件下乙醇超過(guò)60mmol/L閾值即造成缺氧死亡。對(duì)褐色木質(zhì)根中乙醇含量研究結(jié)果表明,乙醇含量變化與褐色木質(zhì)根中ADH活性增加幅度相吻合。T1褐色木質(zhì)根中ADH活性增加幅度大于T2有可能造成其乙醇積累超過(guò)閾值導(dǎo)致T1褐色木質(zhì)根細(xì)胞較早受害,而T2褐色木質(zhì)根ADH活性增加幅度小,另外也可能T2褐色木質(zhì)根代謝乙醇的能力較強(qiáng),使乙醇積累沒(méi)有超出某一閾值,雖對(duì)細(xì)胞造成一定傷害,但受害程度較T1輕,但造成甜櫻桃根系細(xì)胞受害的乙醇閾值還有待進(jìn)一步研究。Hoffman等對(duì)大麥的研究結(jié)果表明LDH在嚴(yán)重低氧條件下能保持長(zhǎng)時(shí)間的高活性,而Huang研究認(rèn)為隨著細(xì)胞質(zhì)pH值的下降,LDH活性受抑,Davies等人研究表明低氧初