銀杏內(nèi)酯b及其前藥脂水分配系數(shù)測(cè)定方法的研究

銀杏內(nèi)酯b及其前藥脂水分配系數(shù)測(cè)定方法的研究

銀杏籽是提取銀杏葉片的主要有效成分，包括銀杏籽a(bǔ)、b、c、j、m等?，F(xiàn)代藥理研究表明,銀杏內(nèi)酯均是天然的血小板活化因子(plateletactivatingfactor,PAF)受體拮抗劑,其中銀杏內(nèi)酯B(GB)活性最強(qiáng)。此外,GB還具有抗腦缺血、抗氧化、抗菌抗炎、抗過敏和抗休克等作用。藥物在體內(nèi)溶解、吸收、分布、代謝與藥物的水溶性和脂溶性密切相關(guān),即和脂水分配系數(shù)(logP)相關(guān),尤其是治療腦部疾病的藥物。為增加GB的脂溶性,提高通過血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)的能力,本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成了GB前藥(PGB),結(jié)構(gòu)(見圖1)。有關(guān)銀杏內(nèi)酯及其前藥脂水分配系數(shù)的測(cè)定,文獻(xiàn)中未見相關(guān)報(bào)道。借鑒其它化合物測(cè)定方法[9,10,11,12,13,14,15],本文采用搖瓶法及高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定GB及其前藥脂水分配系數(shù),對(duì)比二者脂溶性差別,驗(yàn)證結(jié)構(gòu)改性對(duì)脂溶性的影響,為后續(xù)結(jié)構(gòu)修飾及其它藥學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。1試驗(yàn)設(shè)備及儀器高效液相色譜儀,配有515高壓泵、2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)、2487紫外光譜檢測(cè)器(UVD)、996二極管陣列檢測(cè)器(PDA)、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司);MettlerToledoAG135電子天平(德國METTLER公司);HQ45Z恒溫?fù)u床(武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司);XW-80A微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);SC2201超聲儀(上海小巖工貿(mào)發(fā)展有限公司);DHG-92021SA電熱恒溫干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。GB及PGB(純度>99%,由農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心提供);超純水;甲醇、四氫呋喃、正辛醇、正丁醇、醋酸乙酯(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。2方法和結(jié)果2.1gbpgb溶液的配制室溫條件下,將正辛醇與二次蒸餾水于恒溫?fù)u床中振蕩24h至相互飽和,靜置過夜分層,兩相分離。用正辛醇(二次蒸餾水飽和的)分別配制1.0和0.1mg/ml的GB﹑PGB溶液。上述溶液都應(yīng)避光保存?zhèn)溆谩?.2hplc-uvd法色譜柱為SymmetryShieldTMRP18(3.9mm×150mm,5μm);流動(dòng)相為GB:甲醇:四氫呋喃:水=28:15:57,PGB:甲醇:四氫呋喃:水=43:15:42(V/V/V);檢測(cè)器種類及參數(shù):GB:Waters2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,氮?dú)?5psi,漂移管溫度55℃,增益100.00%,噴霧器級(jí)別60%,PGB:Waters2487紫外光譜檢測(cè)器,波長(zhǎng)288nm;柱溫25℃;流速0.8ml/min;進(jìn)樣量10μl。GB甲醇溶液、GB正辛醇溶液、GB飽和水溶液按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)(見圖2)。由圖2可知,3種溶液GB保留時(shí)間均適宜且相互一致,峰形正常,說明此方法適用于GB的脂水分配系數(shù)測(cè)定。PGB甲醇溶液和PGB飽和水溶液按GB的色譜方法進(jìn)樣(見圖3)。由圖可知,PGB甲醇溶液中PGB物質(zhì)峰保留時(shí)間適宜,峰形較好;而PGB飽和水溶液在相同條件下未得到對(duì)應(yīng)色譜峰。因此,HPLC-ELSD不適用于測(cè)定PGB脂水分配系數(shù)。考慮到PGB具有紫外吸收,故可采用HPLC-UVD測(cè)定脂水分配系數(shù)。對(duì)PGB甲醇溶液進(jìn)行紫外吸收全波長(zhǎng)掃描(見圖4)。由圖可知,PGB在λ=288nm處有最大吸收,選為紫外檢測(cè)波長(zhǎng),得到PGB飽和水溶液紫外色譜圖,檢測(cè)效果良好。在上述色譜條件下,GB和PGB的保留時(shí)間分別為6.990min,9.658min。2.3線性關(guān)系及線性回歸分析用甲醇分別配制0.5mg/ml的GB和PGB標(biāo)準(zhǔn)母液,并稀釋得10,20,50,100,200μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以GB質(zhì)量濃度C(μg/ml)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),峰面積A對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(n=6),得回歸方程為:lgA=1.209lgc+3.448,r=0.9989;以PGB質(zhì)量濃度c(μg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(n=6),得回歸方程為:A=20357C-32048,r=0.9998。結(jié)果表明GB和PGB在10～500μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。以色譜峰信噪比大于3為標(biāo)準(zhǔn),在上述色譜條件下GB和PGB的最低檢測(cè)限為10μg/ml,5μg/ml。2.4進(jìn)樣精密度試驗(yàn)分別取質(zhì)量濃度為50μg/mlGB甲醇溶液和PGB甲醇溶液,按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定計(jì)算RSD分別為0.15%、0.89%,均小于藥典規(guī)定的2%,表明方法精密度符合要求。2.5u3000定了正辛醇溶液中g(shù)b含量低且添加量低的原因長(zhǎng)分別取10ml0.1mg/ml﹑1.0mg/mlGB正辛醇溶液與10ml二次蒸餾水(正辛醇飽和)混合振蕩,振蕩時(shí)間依次為1,2,3,4,5,7h,每一濃度各處理5瓶。分離水相和脂相,檢測(cè)水相中GB濃度,當(dāng)濃度不再增加時(shí),即為平衡時(shí)間。結(jié)果表明,隨著振蕩時(shí)間延長(zhǎng),水相中GB濃度逐漸增加,但增加有限。由于0.1mg/mlGB正辛醇溶液中GB含量低,在短時(shí)間內(nèi)即可基本完成從脂相到水相的轉(zhuǎn)移。而1.0mg/mlGB正辛醇溶液,振搖5h后,水相濃度RSD=0.45%,說明GB在水相中已達(dá)飽和。最終確定平衡時(shí)間分別為3～5h。另取10ml0.1mg/mlPGB正辛醇溶液與10ml二次蒸餾水(正辛醇飽和),5ml1.0mg/mlPGB正辛醇溶液與25ml二次蒸餾水(正辛醇飽和)混合振蕩,測(cè)定不同振蕩時(shí)間水相中PGB濃度。結(jié)果表明,隨著兩相振蕩時(shí)間延長(zhǎng),水相中PGB濃度不斷增加。0.1mg/mlPGB正辛醇溶液,振搖3,5,7h水相PGB濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%,表明3～7h水相中PGB濃度基本不變化,反映振蕩體系中PGB含量少,兩相中的傳質(zhì)過程可較快完成,體系易達(dá)平衡狀態(tài)。1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,振搖時(shí)間4-7h,水相中PGB濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%,濃度基本無變化。最終確定平衡時(shí)間分別為3h,4h。2.6pgb在水相和脂相中穩(wěn)定性按2.5方法處理各濃度GB及PGB溶液,振蕩至平衡時(shí)間后分離兩相,于0,2,4,6,8,10,24h分別測(cè)定脂相和水相中GB及PGB濃度,計(jì)算峰面積或其對(duì)數(shù)值RSD。結(jié)果表明:0.1mg/ml和1.0mg/mlGB正辛醇溶液水相和脂相中GB峰面積RSD分別為1.52%、0.75%和0.91%、1.85%,說明色譜峰面積無明顯變化,GB在水相和脂相中24h內(nèi)穩(wěn)定。對(duì)于0.1mg/mlPGB正辛醇溶液,0-8h水相PGB峰面積RSD=1.49%<2%,而0～10hRSD=9.67%>2%;1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,0～10h水相測(cè)定PGB峰面積RSD=1.79%<2%,而0-24hRSD=10.3%>2%,由此可知PGB在水相中至少8h內(nèi)保持穩(wěn)定。0-24h,脂相中的PGB峰面積RSD分別為1.40%,1.37%,說明PGB色譜峰面積無明顯變化,脂相中24h內(nèi)測(cè)試供試品溶液穩(wěn)定。2.7正辛醇/水分配系數(shù)測(cè)定10ml0.1mg/mlGB正辛醇溶液與10ml二次蒸餾水(1∶1),混合25℃振搖3h,10ml1.0mg/mlGB正辛醇溶液與50ml二次蒸餾水(1∶5)混合振搖5h,分離有機(jī)相和水相,檢測(cè)其中GB濃度。其中1.0mg/mlGB分離有機(jī)相用甲醇稀釋10倍后進(jìn)樣。按下式計(jì)算正辛醇/水分配系數(shù),每一濃度平行測(cè)定3次。正辛醇/水分配系數(shù)計(jì)算公式:lgP=lg(CoCw)lgΡ=lg(CoCw),式中:Co表示化合物在正辛醇中的濃度;Cw表示化合物在水相中的濃度。GB測(cè)定及計(jì)算結(jié)果如表1所示。對(duì)兩個(gè)濃度測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,F=0.51,而F0.25(1,4)=1.81>F=0.51,由此說明不同濃度對(duì)GB脂水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果無明顯差異。GB在正辛醇-水溶劑體系中的分配系數(shù)為0.59。同法處理PGB溶液,濃度測(cè)定及脂水分配系數(shù)計(jì)算結(jié)果如表2所示。對(duì)兩個(gè)濃度測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,F=6.38,而F0.10(1,4)=1.81<F<F0.05(1,4)=7.71,可見濃度對(duì)PGB脂水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果有一定影響,不同濃度下PGB脂水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果存在一定差異。PGB在正辛醇-水溶劑體系中的脂水分配系數(shù)lgP為1.05。2.8影響因素研究2.8.1脂水兩相體積比10ml1.0mg/mlGB正辛醇溶液分別按1∶1,1∶5,1∶10(V/V)加入二次蒸餾水混合振搖5h,分離脂水兩相,測(cè)定GB濃度。脂相用甲醇稀釋10倍后進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果見表3。由方差分析可知,F=147.25,查F分布表知F0.01(2,6)=10.92<F,即脂水兩相體積比對(duì)脂水分配系數(shù)結(jié)果有顯著性影響。GB正辛醇溶液與二次蒸餾水體積比為1∶1混合,GB從脂相進(jìn)入水相,實(shí)現(xiàn)傳質(zhì)過程,由于二次蒸餾水體積小,傳質(zhì)平衡前GB在水相中已達(dá)過飽和狀態(tài),剩余GB無法進(jìn)入水相而留存于正辛醇中。GB正辛醇溶液與二次蒸餾水按體積比1∶5和1∶10混合,GB在兩相中可達(dá)分配平衡,在水相中仍未達(dá)飽和狀態(tài),測(cè)定結(jié)果均準(zhǔn)確。但取等量GB正辛醇溶液實(shí)驗(yàn),后者正辛醇飽和的二次蒸餾水耗量增加一倍,故確定GB正辛醇溶液與二次蒸餾水的體積比為1∶5。2.8.2脂水分配系數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)分離脂相待測(cè)液采用不同稀釋溶劑及稀釋比例,PGB色譜峰的峰形和保留時(shí)間差別明顯。分別用正辛醇、正丁醇和甲醇10倍稀釋1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,相同色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果表明甲醇、正丁醇、正辛醇稀釋樣PGB色譜峰保留時(shí)間逐一縮短,分別為9.292,9.075,7.115min,并且峰形差異較大。說明采用不同溶劑稀釋脂相,將改變體系中PGB狀態(tài),并最終影響其脂水分配系數(shù)的檢測(cè)結(jié)果。有關(guān)溶劑影響PGB脂水分配系數(shù)測(cè)定的機(jī)理還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。用甲醇按不稀釋、10倍和50倍稀釋1.0mg/mlPGB正辛醇溶液,HPLC-UVD檢測(cè)。結(jié)果如表4所示。PGB正辛醇溶液隨著稀釋倍數(shù)的擴(kuò)大,保留時(shí)間延遲,峰形適宜,峰面積相差較小(RSD=2.2%)。選擇正辛醇為脂相溶劑,可模擬生物膜相測(cè)定藥物脂水分配系數(shù)。實(shí)驗(yàn)操作發(fā)