生物化學實驗(同名186)

生物化學實驗講義化學工程與技術學院基礎部

實驗一酪蛋白的制備一、目的學習從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。二、原理．牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點為4.7。利用等電點時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純的酪蛋白。三、器材1、離心機2、．抽濾裝置3、精密pH試紙或酸度計4、電爐5、燒杯6、溫度計．四、試劑與材料1、牛奶2500mL2、95％乙醇1200mL3、無水乙醚1200mL4、0.2mol／LpH4.7醋酸—醋酸鈉緩沖液3000mL5、．乙醇—乙醚混合液2000mL五、操作將100mL牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入預熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液100mL。用精密pH試紙或酸度計調(diào)pH至4.7。將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘(3000r／min)。棄去清液，得酪蛋白粗制品。用水洗沉淀3次，離心10分鐘(3000r／min)，棄去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀攤開在表面皿上，風干；得酪蛋白純晶。準確稱重，計算含量和得率。含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)得率：思考題1、制備高產(chǎn)率純酪蛋白的關鍵是什么？實驗二小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較一、目的1.學習分光光度計的原理和使用方法。2.學習測定淀粉酶活力的方法。3.了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。二、原理種子中貯藏的糖類主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解為麥芽糖。2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11麥芽糖有還原性，能使3，5---二硝基水楊酸還原成棕色的3-氨基-5-硝基水揚酸。后者可用分光光度計測定。休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌動后，酶活力逐漸增強，并隨著發(fā)芽天數(shù)增加而增加。本實驗觀察小麥種子萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。三、器材1.25mL刻度試管2.吸管3.離心管4.乳缽5.分光光度計6.恒溫水浴7.離心機四、試劑和材料1、小麥種子2、o.1％標準麥芽糖溶液精確稱量100mg麥芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度。3.pH6.9，0.02mol/L磷酸緩沖液0.2mol/L磷酸二氫鉀67.5mL與0.2mol/L磷酸氫二鉀82.5混合，稀釋10倍。4、1％淀粉溶液1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸緩沖液中，其中含有0.0067mol/L氯化鈉。5、1％3，5—二硝基水楊酸試劑將1.00g3，5—二硝基水揚酸溶于20ml2ML1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸鉀鈉定容至100ml。6、1％氯化鈉溶液五、實驗操作1、種子發(fā)芽小麥種子浸泡2.5小時后，放入25℃恒溫箱內(nèi)或在、室溫下發(fā)芽。2、酶液提取取發(fā)芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳缽內(nèi)，加入1%氯化鈉溶液10mL，用力磨碎。在室溫下放置20分鐘，攪拌幾次。然后將提取液離心（1500r/min）6—7分鐘。將上清液倒人量筒，測定酶提取液的總體積。進行酶活力測定時，用緩沖液將發(fā)芽第3或第4天的幼苗稀釋10倍。取干燥種子15粒作對照（提取步驟同上）。3、酶活力測定（1）取25mL刻度試管4支，編號。按下表要求加入各試劑（各試劑須在25℃預熱10分鐘）試管標號試劑1234干燥種子的酶提取液發(fā)芽第3或第4天的幼苗的酶提取液標準管空白管酶液（mL）0.50.5——標準麥芽糖溶液（mL）——0.5—1％淀粉溶液（mL）1111水（mL）———0.5將各管混勻，放在25℃水浴中，保溫3分鐘后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水楊酸溶液2mL。（2）取出各試管，放入沸水浴加熱5分鐘。冷卻至室溫，加水稀釋至25mL。并混勻。在A500nm處測定各管的吸光度。填入表中試管號干燥種子的酶提取液發(fā)芽第3或第4天的幼苗的酶提取液標準管空白管A500nm吸光度4、計算根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關系，本實驗規(guī)定：25℃時3min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個酶活力單位（u）。酶活力計算公式為：式中：C酶酶液麥芽糖的濃度，V酶提取酶液的總體積，n酶酶液稀釋倍數(shù)。思考題為什么此酶提純整個過程在0—5條件下進行？而測酶的活力時要在25預保溫？反應后又放入沸水浴中？實驗結(jié)果說明什么？實驗三紙層析法分離鑒定氨基酸一、目的通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理及操作方法。二、原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機溶劑和水組成。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值(比移)來表示的：…在一定的條件下某種物質(zhì)的只Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。三、器材1.層析缸2.毛細管3.噴霧器4.培養(yǎng)皿5.層析濾紙(新華一號)四、試劑1、擴展劑650mL4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，與15mL水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴展劑約5mL置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒人培養(yǎng)皿中備用。2、氨基酸溶液0.5％的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液(各組份濃度均為0.5％)。各5mL3、顯色劑50～100mL1％水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1.將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。2.取層析濾紙(長22cm、寬14cm)一張。在紙的—端距邊緣2～3cm處用用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號如圖。3.點樣用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這6個位置上，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。4.擴展用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20mL擴展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中(點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1cm)。待溶劑上升15—20cm時即取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機熱風吹干。5.顯色用噴霧器均勻噴上O.1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘(100℃)或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。6.計算各種氨基酸的只Rf值。思考題1、何謂紙層析法?2、何謂片Rf值?影響Rf值的主要因素是什么?3、怎樣制備擴展劑?層析缸中平衡溶劑的作用是什么？實驗四酶的特性一、目的加深對酶的性質(zhì)的認識。二、內(nèi)容本實驗由溫度對酶活力的影響；pH對酶活力的影響；酶的激活劑及抑制劑；酶的?！?組實驗組成。(一)溫度對酶活力的影響1、原理酶的催化作用受溫度的影響。在最適溫度下，酶的反應速度最高。大多數(shù)動物酶的最適溫度為37-40℃，植物酶的最適溫度為50～60℃。酶對溫度的穩(wěn)定性與其存在形式有關。有些酶的干燥制劑，雖加熱到100℃，其活性井無明顯改變，但在100℃的溶液中卻很快地完全失去活性。低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2、器材(1)試管及試管架(2)恒溫水浴(3)冰浴(4)沸水浴3、試劑和材料(1)0.2％淀粉的0.3％氯化鈉溶液150mL需新鮮配制(2)稀釋200倍的唾液50mL用蒸餾水漱口，以清除食物殘渣，再含一口蒸餾水，半分鐘后使其流入量筒并稀釋200倍(稀釋倍數(shù)可根據(jù)各人唾液淀粉酶活性調(diào)整)，混勻備用。(3)碘化鉀—碘溶液50mL將碘化鉀20g及碘l0g溶于100mL水中。使用前稀釋10倍。4、操作淀粉和可溶性淀粉遇碘呈藍色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈藍色、紫色、暗褐色或紅色。最簡單的糊精遇碘不呈顏色，麥芽糖遇碘也不呈色。在不同溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色來判斷。取3支試管，編號后按下表加入試劑：管號123淀粉溶液(mL)1.51.51.5稀釋唾液(mL)11—煮拂過的稀釋唾液(mL)——1搖勻后，將1、3號兩試管放入37℃恒溫水浴中，2號試管放人冰水中。10分鐘后取出(將2號管內(nèi)液體分為兩半)，用碘化鉀—碘溶液來檢驗1、2、3號管內(nèi)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。記錄并解釋結(jié)果，將2號管剩下的一半溶液放人37℃水浴中繼續(xù)保溫10分鐘后，再用碘液實驗，結(jié)果如何?(二)pH對酶活性的影響1、原理酶的恬力受環(huán)境pH的影響極為顯著。不同酶的最適pH值不同。本實驗觀察pH對唾液淀粉酶活性的影響，唾液淀粉酶的最適pH約為6.8。2．器材(1)試管及試管架(2)吸管(3)滴管(4)50mL錐形瓶5)恒溫水浴3、試劑和材料(1)新配制的溶于0.3％氯化鈉的0.5％淀粉溶液250mL(2)稀釋200倍的新鮮唾液100mL(3)0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液600mL(4)0.1mol/L檸檬酸溶液400Ml(5)碘化鉀—碘溶液50mL(6)pH試紙pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8四種4、操作取4個標有號碼的50mL錐形瓶。用吸管按下表添加0.2mol／L磷酸氫二鈉溶液和0.1mol/L檸檬酸溶液以制備pH5.0～8.0的4種緩沖液。錐形瓶號碼0.2mol／L磷酸氫二鈉0.1mol/L檸檬酸pH15.154.855.026.053.955.837.722.286.849.720.288.0從4個錐形瓶中各取緩沖液3mL，分別注入4支帶有號碼的試管中，隨后于每個試管中添加0.5％淀粉溶液2mL和稀釋200倍的唾液2mL。向各試管中加入稀釋唾液的時間間隔各為1分鐘。將各試管中物質(zhì)混勻，并依次置于37℃恒溫水浴中保溫。待向第4管加入唾液2分鐘后，每隔1分鐘由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化鉀—碘溶液，檢驗淀粉的水解程度。待混合液變?yōu)樽攸S色時，向所有試管依次添加1—2滴碘化鉀—碘溶液。添加碘化鉀—碘溶液的時間間隔，從第1管起，亦均為1分鐘。觀察各試管中物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色，分析pH對唾液淀粉酶活性的影響。三)唾液淀粒酶的活化和抑制1、原理酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。2、器材(1)恒溫水浴(2)試管及試管架3、試劑和材料(1)0.1％淀粉溶液150mL(2)稀釋200倍的新鮮唾液150mL(3)1％氯化鈉溶液50mL(4)1％硫酸銅溶液50mL(5)1％硫酸鈉溶液50mL(6)碘化鉀—碘溶液100mL4、操作管號12340.1％淀粉溶液(mL)1.51.51.51.5稀釋唾液(mL)0.50.50.50.5l％硫酸銅溶液(mL)0.5———1％氯化鈉溶掖(mL)—0.5——1％硫酸鈉溶液(mL)——0.5—蒸餾水(mL)———0.537℃恒溫水浴、保溫10分鐘碘化鉀—碘溶液(滴)2～32～32～32～3現(xiàn)象解釋結(jié)果；說明本實驗第3管的意義。（四）酶的專一姓1.原理酶具有高度的專一性。本實驗以唾液淀粉酶和蔗糖酶對淀粉和蔗糖的作用為例，來說明酶的專一性。淀粉和蔗糖無還原性。唾液淀粉酶水解淀粉生成有還原性的麥芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解產(chǎn)生還原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用Benedict試劑檢查糖的還原性。2、器材．(1)恒溫水浴(2)沸水浴(3)試管及試管架3、試劑和材料(1)2％蔗糖溶液150mL(2)溶于0.3％氯化鈉的1%淀粉溶液150mL需新鮮配制間隔各為1分鐘。將各試管中物質(zhì)混勻，并依次置于37℃恒溫水浴中保溫。(3)稀釋200倍的新鮮唾液100mL(4)蔗糖酶溶液100mL將啤酒廠的鮮酵母用水洗滌2～3次(離心法)，然后放在濾紙上自然干燥。取干酵母100g，置于乳缽內(nèi)，添加適量蒸餾水及少量細沙，用力研磨提取約1小時，再加蒸餾水使總體積約為原體積的10倍。離心，將上清液保存于冰箱中備用。(5)Benedict氏試劑200mL無水硫酸銅17.4g溶于100mL熱水中，冷卻后稀釋至150mL。取檸檬酸鈉173g，無水碳酸鈉100g和600mL水共熱，溶解后冷卻并加水至850mL。再將冷卻的150mL硫酸銅溶液傾入。本試劑可長久保存。4、操作（1）淀粉酶的專一性管號1234561％淀粉溶液(滴)4—4—4—2%蔗糖溶液(滴)—4—4—4稀釋唾液(mL)——11——煮沸過的稀釋唾液(mL)————11蒸餾水(mL)11————37℃恒溫水浴15分鐘Benedict試劑(mL)111111沸水浴2—3分鐘│現(xiàn)象解釋實驗結(jié)果(提示：唾液除含淀粉酶外還含有少量麥芽糖酶)。（2）蔗糖酶的專一性管號1234561％淀粉溶液(滴)4—4—4—2%蔗糖溶液(滴)—4—4—4蔗糖酶溶液(mL)——11——煮沸過的蔗糖酶溶液(mL)————11蒸餾水(mL)11————37℃恒溫水浴15分鐘Benedict試劑(mL)111111沸水浴2—3分鐘│現(xiàn)象解釋實驗結(jié)果。思考題1、什么是酶的最適溫度及其應用意義?2、什么是酶反應的最適pH?對酶活性有什么影響?3、什么是酶的活化劑?4、什么是酶的抑制劑?與變性劑有何區(qū)別?5、本實驗結(jié)果如何證明酶的專一性?實驗五菜花中核酸的分離和鑒定一、目的初步掌握從菜花中分離核酸的方法，和RNA、DNA的定性檢定。二、原理用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子物質(zhì)，再用有機溶劑，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物質(zhì)。最后用濃鹽溶液(10％氯化鈉溶液)和0.5mol／L高氯酸(70℃)分別提取DNA和RNA，再進行定性檢定。由于核糖和脫氧核糖有特殊的顏色反應，經(jīng)顯色后所呈現(xiàn)的顏色深淺在一定范圍內(nèi)和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比，因此可用此法來定性、定量測定核酸。1、核糖的測定測定核糖的常用方法是苔黑酚(即3，5—二羥甲苯法)。當含有核糖的RNA與濃鹽酸及3，5—二羥甲苯在沸水浴中加熱10—20分鐘后，有綠色物產(chǎn)生，這是因為RNA脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3，5—二羥甲苯作用產(chǎn)生綠色物質(zhì)。DNA、蛋白質(zhì)和粘多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。2．脫氧核糖的測定測定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱10分鐘后，產(chǎn)生藍色。這是因為DNA嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω—羥基—6—酮基戊醛，它再和二苯胺作用產(chǎn)生藍色物質(zhì)。100℃DNA+二苯胺試劑藍色物此法易受多種糖類及其衍生物和蛋白質(zhì)的干擾。上述兩種定糖的方法準確性較差，但快速、簡便，能鑒別DNA與RNA，是檢定核酸、核苷酸的常用方法。三、器材1．恒溫水浴2．電爐3，離心機4．布氏漏斗裝置5．吸管6．燒杯7．量筒8．剪刀四、試劑和材料1、新鮮菜花2、95％已醇600mL3、丙酮400mL4、5％高氯酸溶液200mL5、0.5mo1/L高氯酸溶液200mL6、10％氯化鈉溶液400mL7、標準RNA溶液(5mg／l00mL)50mL8、標準DNA溶液(15mg／100mL)50mL9．粗氯化鈉250g10．海砂5g11．二苯胺試劑60mL將1g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入2.75mL濃硫酸(置冰箱中可保存6個月。使用前，在室溫下?lián)u勻)。12．三氯化鐵濃鹽酸溶液25mL13．苔黑酚乙醇溶液200mL1、核酸的分離(1)取菜花的花冠20g，剪碎后置于研缽中，加入20mL95%乙醇和400mg海砂，研磨成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。(2)濾渣中加入20mL丙酮，攪拌均勻，抽濾，棄去濾液。(3)再向濾渣中加入20mL丙酮，攪拌5分鐘后抽干(用力壓濾渣，盡量除去丙酮)。(4)在冰鹽浴中，將濾渣懸浮在預冷的20mL5％高氯酸溶液中。攪拌，抽濾，棄去濾液。(5)將濾渣懸浮于20mL95％乙醇中，抽濾，棄去濾液。(6)濾渣中加人20mL丙酮，攪拌5分鐘，抽濾至于，用力壓濾渣盡量除去丙酮。(7)將干燥的濾渣重新懸浮在40mL10％氯化鈉溶液中。在沸水浴中加熱15分鐘。放置，冷卻，抽濾，留濾液。并將此操作重復進行一次。將兩次濾液合并，為提取物一。(8)將濾渣重新懸浮在20mL0.5mol／L高氯酸溶液中。加熱到70℃、保溫20分鐘(恒溫水浴)后抽濾，留濾液(提取物二)?！?．RNA，DNA的定性檢定二苯胺反應管號12345蒸餾水(mL)1--------DNA溶液(mL)--1------RNA溶液(mL)----1----提取物一(mL)------1--攝取物二(mL)--------1二苯胺試劑（mL）22222放沸水浴中10分鐘后的現(xiàn)象（2）苔黑酚反應管號12345蒸餾水(mL)1--------DNA溶液(mL)--1------RNA溶液(mL)----1----提取物一(mL)------1--攝取物二(mL)--------1三氯化鐵濃鹽酸溶液(mL)22222苔黑酚乙醇溶液(mL)0.20.20.20.20.2放沸水浴中10分鐘后的現(xiàn)象思考題1．核酸分離時為什么要除去小分子物質(zhì)和脂類物質(zhì)?本實驗是怎樣除掉的?2．實驗中呈色反應時RNA為什么能產(chǎn)生綠色復合物?DNA產(chǎn)生藍色物質(zhì)?實驗六紫外分光光度法測定核酸的含量一、目的1.了解紫外分光光度計的基本原理和使用方法。2.學習用紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵系統(tǒng)，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收高峰在A260nm波長處。一般在A260nm波長下，每mL含1μgDNA溶液的光吸收值約為0.020，每mL含1μgRNA溶液的光吸收值約為0.022。故測定未知濃度RNA或DNA溶液A260nm波長的光吸收值即可計算出其中核酸的含量。此法操作簡便，迅速。若樣品內(nèi)混雜有大量的核苷酸或蛋白質(zhì)等能吸收紫外光的物質(zhì)，則測定誤差較大，故應設法預先除去。三、器材1.分析天平2.離心機3.容量瓶4.紫外分光光度計5.吸管6.冰浴或冰箱四、試劑1、5%～6%氨水2、鉬酸銨—高氯酸試劑(沉淀劑)如配制200mL可在193mL蒸餾水中加入7mL70%高氯酸和0.5g鉬酸銨。五、操作1.用分析天平準確稱取待測的核酸樣品500mg，加少量蒸餾水調(diào)成糊狀，再加入少量的水稀釋。然后用5%～6%氨水調(diào)至pH7，定容到50mL。2.取2支離心管，向第一支管內(nèi)加人2mL樣品溶液和2mL蒸餾水；向第二支管內(nèi)加入2mL樣品溶液和2mL沉淀劑，以除去大分子核酸作為對照?；靹?。在冰浴或冰箱中放置30分鐘后離心(3000r／min，10分鐘)。從第一管和第二管中分別吸取0.5mL上清液，用蒸餾水定容到50mL。用光程為1cm的石英比色杯，于260mn波長處測其光吸收值(A1和A2)。六、計算如果已知待測的核酸樣品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可將樣品配制成一定濃度的溶液(20～50μg/mL)在紫外分光光度計上直接測定。實驗七總氮量的測定—凱氏定氮法目的學習凱氏定氮法的原理和操作技術。原理常用凱氏定氮法測定天然有機物（如蛋白質(zhì)、核酸及氨基酸）的含氮量。含氮的有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳氫元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是，此反應進行的比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應液的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。甘氨酸的消化過程表示如下：CHCH2NH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+NH32NH3+H2SO4—————（NH4）2SO4弄濃濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸留到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子濃度降低，然后用標準無機酸滴定，直至恢復溶液中原來的氫離子濃度為止，最后根據(jù)使用的標準酸的摩爾數(shù)計算出待測物中的總氮量。三、儀器1.50mL消化管或100mL凱氏燒瓶2.改進型凱氏定氮儀3．50mL容量瓶4．3mL微量滴定管5．分析天平6．烘箱7．電爐8．1000mL蒸餾燒瓶9.小玻璃珠10．遠紅外消煮爐四、試劑1.消化液(過氧化氫：濃硫酸：水二3：2：1)200mL2．粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物16gK2S04與CuS04·5H20以3：1配比研磨混合。3．30％氫氧化鈉溶液1000mL4．2％硼酸溶液500mL5．標準鹽酸溶液(約0．01mol／L)600mL6．混合指示劑(田氏指示劑)50mL由50mL0．1％甲烯藍乙醇溶液與200mL0.1％甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。這種指示劑酸性時為紫紅色，堿性時為綠色。變色范圍很窄且靈敏。7．市售標準面粉和富強粉.各2g五、操作方法改進型凱氏定氮儀改進型凱氏定氮裝置是在傳統(tǒng)凱氏定氮裝置的結(jié)構基礎上改裝而成，其特點是將蒸汽發(fā)生器、蒸餾器和冷凝器組成一個整體，體積小，安裝容易，操作簡便。改進型凱氏蒸餾裝置的結(jié)構如圖所示。圖改進型凱氏蒸餾裝置1.水蒸汽發(fā)生器2.反應室3．水蒸汽排氣孔4．排水排氣孔5.外源水入口6．進樣口7．加樣漏斗8．冷凝器9．冷凝器出口10.自來水入口11．通氣室出口13.通氣室出口14．排水柱15．排水柱入口16．排水柱入口17.冷凝水和廢水出口①②③自由夾可分成3部分來敘述：(1)水蒸汽發(fā)生器和反應室水蒸汽發(fā)生器有3個開口，3、4、5，反應室有1個開口，6。2)冷凝器和通氣室冷凝器有2個開口，9、10，通氣室有有2個開口，12、13(3)排水柱排水柱有3個開口，15、16、17。安裝時，先將主體部分固定在支架上，其底部放上電爐。然后將5與13；4與16；12與15；6與7用橡皮管連接，并放上自由夾。最后長橡膠管連接進水口10和出水口172．樣品處理某一固體樣品中的含氮量是用l00g該物質(zhì)(干重)中所含氮的g數(shù)來表示(%)。因此在定氮前，應先將固體樣品中的水分除掉。一般樣品烘干的溫度都采用105℃，因為非游離的水都不能在100℃以下烘干。在稱量瓶中稱人一定量磨細的樣品，然后置于105℃的烘箱內(nèi)干燥4小時。用坩堝鉗將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1小時后，稱重—次，直到兩次稱量數(shù)值不變，即達恒重。精確稱取0.1g左右的干燥面粉作為本實驗的樣品。3．消化取4個100mL凱氏燒瓶或50mL消化管并標號。各加1顆玻璃珠，在1及2號瓶中各加樣品0.1g，催化劑(K2S04—CuS04·5H20)200mg，消化液5mL。注意加樣品時應直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3及4號瓶中各加0.1mL蒸餾水和與1及2號瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。每個瓶口放一漏斗，在通風櫥內(nèi)的電爐上消化。在消化開始時應控制火力，不要使液體沖到瓶頸待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出S02白煙后，適當加強火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。消化完畢，等燒瓶中溶物冷卻后，加蒸餾水10mL(注意慢加，隨加隨搖)。冷卻后將瓶中溶物傾入50mL的容量瓶中，并以蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，將洗液并人量瓶。用水稀釋到刻度，混勻備用。4，蒸餾(1)蒸餾器的洗滌接通冷凝水，先向蒸汽發(fā)生器中加入一定量的水(以排水口高度為宜)用電爐將其加熱燒開。然后將蒸餾水由加樣室加入反應室，水即自動吸出，或者將電爐移開片刻，或者打開自由夾，使冷水進入蒸汽發(fā)生器，都可使反應室中的水自動吸出，如此反復清洗3—5次。清洗后在冷凝管下端放一錐形瓶盛有5mL，12％硼酸溶液和1～2滴指示劑的混合液。蒸餾數(shù)分鐘后，觀察錐形瓶內(nèi)溶液是否變色，如不變色則表明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。(2)蒸餾取50mL錐形瓶數(shù)個，各加入5mL12％硼酸溶液和1～2滴指示劑，溶液呈淡紫色，用表面皿覆蓋備用。關閉冷凝水，打開自由夾，使蒸汽發(fā)生器與大氣相通。將一個盛有硼酸和指示劑溶液的錐形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸沒在液體內(nèi)。用移液管取5mL消化液，細心地由加樣室下端加入反應室，隨后將已準備好的30％NaOH溶液5mL加入，關閉自由夾，在加樣漏斗中加少量水做水封。關閉自由夾打開冷凝水(注意不要過快過猛，以免水溢出)。當觀察到錐形瓶中的溶液由紫變綠時(約2—3分鐘)，開始計時，蒸餾3分鐘，移開錐形瓶，使冷凝器下端離開液面約1cm，同時用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外側(cè)，繼續(xù)蒸餾1分鐘，取下錐形瓶，用表面皿覆蓋瓶口。蒸餾完畢后，應立即清洗反應室，方法如前所述。打開自由夾，將水放出，再加熱，再清洗，如此3—5次。最后將自由夾①、③同時打開，將蒸汽發(fā)生器內(nèi)的全部廢水換掉。關閉夾子，再使蒸汽通過整個裝置數(shù)分鐘后，繼續(xù)下一次蒸餾。待樣品和空白消化液均蒸餾完畢，同時進行滴定。(3)滴定全部蒸餾完畢后，用標準鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠變淡紫色為滴定終點。(4)計算c為標準鹽酸溶液摩爾濃度；v1為滴定樣品用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；v2為滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；w為樣品重量(g)。14為氮的相對量子質(zhì)量。若測定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)，則，樣品中蛋白質(zhì)含量(％)=總氮量x6．25若樣品中除有蛋白質(zhì)外，尚有其他含氮物質(zhì)，則需向樣品中加入三氯乙酸，然后測定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及總氮量，從而計算出蛋白氮，再進一步算出蛋白質(zhì)含量。蛋白氟=總氮—非蛋白氮蛋白質(zhì)含量(g%)=蛋白氮×6.25思考題1、何謂消化?如何判斷消化終點?2、．在實驗中加入粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物的作用是什么?3．固體樣品為什么要烘干?4．蒸餾時冷凝管下端為什么要浸沒在液體中?5．如何證明蒸餾器洗滌干凈?6．本實驗應如何避免誤差?實驗八血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳目的學習醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術的一般原理二、原理醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄