生物化學(xué)考點(diǎn)小結(jié)

生物化學(xué)考點(diǎn)小結(jié)第一部分蛋白質(zhì)一、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類A、氨基酸的通式1、構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，均為-氨基酸(脯氨酸除外)2、α-氨基酸有兩種構(gòu)型:D構(gòu)型和L構(gòu)型，是與甘油醛或乳酸相比較而決定的3、蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-型4、共同點(diǎn)為在同一碳原子上有羧基、氨基、和氫；不同點(diǎn)是側(cè)鏈R基不同B、20種氨基酸的分類1、按照側(cè)鏈R基團(tuán)結(jié)構(gòu)a、脂肪族氨基酸（1）酸性氨基酸：Asp、Asn、Glu、Gln（2}堿性氨基酸：Arg、Lys（3）中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Metb、芳香族氨基酸：Phe、Tyrc、雜環(huán)氨基酸：His、Trp、Pro2、按照側(cè)鏈R基團(tuán)極性3、根據(jù)生物體的需要必需氨基酸：Lys、Val、Ile、Leu、Phe、Met、Trp、Thr半必需氨基酸：Arg、His非必需氨基酸：其余氨基酸特殊性質(zhì)的氨基酸GlyR=H無側(cè)鏈，無空間位阻，柔性大，無手性CAlaR=-CH3小，可在蛋白質(zhì)內(nèi)部和表面Val，Ile，LeuR大，位阻大，易在蛋白質(zhì)中固定某一位置，利于折疊Pro亞氨酸，使肽鏈形成一個(gè)轉(zhuǎn)角，改變主鏈方向。常暴露于蛋白質(zhì)表面Cys-SH，易形成二硫鍵，與金屬離子配位結(jié)合。通常藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部AspGlu2-COOH相應(yīng)的酰胺為AsnGlnHis咪唑基可接受H+或供H+Lys，Arg2個(gè)-NH2，帶正電荷，存在蛋白質(zhì)表面，可形成離子鍵。LysR長，可自由伸展，與蛋白質(zhì)結(jié)合功能有關(guān)Arg藏在內(nèi)部氨基酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)氨基酸的理化性質(zhì)氨基酸的光學(xué)性質(zhì)：旋光性和紫外吸收（2）氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時(shí)主要時(shí)以兩性離子的形式存在氨基酸在水中的兩性離子既能像酸一樣放出質(zhì)子，也能像堿一樣接受質(zhì)子，氨基酸具有酸堿性質(zhì)，是一類兩性電解質(zhì)氨基酸的等電點(diǎn)pI不同pH時(shí)氨基酸以不同的離子化形式存在氨基酸所帶凈電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectricpoint），以pI表示1、當(dāng)溶液的pH=pI時(shí)，氨基酸主要以兩性離子形式存在2、pH<pI時(shí)，氨基酸主要以正離子形式存在3、pH>pI時(shí)，氨基酸主要以負(fù)離子形式存在A、等電點(diǎn)的計(jì)算1、中性氨基酸：pI=（pK1+pK2）/22、酸性氨基酸：pI=（pK1+pKR）/23、堿性氨基酸：pI=（pKR+pK3）/2B、氨基酸的酸堿性質(zhì)在等電點(diǎn)以上的任何pH值，氨基酸帶凈負(fù)電荷，在電場中將向正極移動(dòng)在低于等電點(diǎn)的任何pH值，氨基酸帶凈正電荷，在電場中將向負(fù)極移動(dòng)在一定pH范圍內(nèi)，氨基酸溶液的pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，氨基酸所攜帶的凈電荷越大習(xí)題用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂分離下列每對氨基酸，當(dāng)用pH7.0的緩沖液洗脫時(shí)，下述每對氨基酸中先從柱上洗脫下來的是那種氨基酸？（1）天冬氨酸和賴氨酸，（2）精氨酸和甲硫氨酸，（3）谷氨酸和纈氨酸，（4）甘氨酸和亮氨酸答案1、Asp凈電荷為負(fù)，Lys靜電荷為正，Lys與樹脂磺酸基相反離子吸附作用大，故Asp>Lys2.Arg凈電荷為正，Met靜電荷接近零，故Met>Arg3.Glu凈電荷為負(fù)，Val凈電荷接近零，故Glu>Val4.Gly和Leu凈電荷都接近零，但Leu的非極性側(cè)鏈與樹脂骨架之間的非極性相互作用大，故Gly>Leu四、肽1、肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸通過肽鍵連接而形成的化合物，氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）2、肽鏈書寫方式：N端→C端，游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸殘基之間用“-”表示肽鍵3、命名：根據(jù)氨基酸組成，由N端→C端命名4、肽的化學(xué)性質(zhì)與氨基酸相似，如兩性解離、等電點(diǎn)等，但肽有與氨基酸不同的特殊反應(yīng)（1）、雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲＋堿性CuSO4溶液紫色（2）肽鍵的紫外吸收 210～230nm五、蛋白質(zhì)1、蛋白質(zhì)平均含N量為16％,這是凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含N量/(16%)=蛋白質(zhì)含N量*6.252、蛋白質(zhì)分子量的估算:110*氨基酸數(shù)(kDa)。3、、蛋白質(zhì)的水解a、酸水解：多數(shù)氨基酸穩(wěn)定，不引起消旋作用；Trp完全被破壞，羥基氨基酸部分分解，Gln和Asn的酰胺基被水解b、堿水解：Trp穩(wěn)定；多數(shù)氨基酸被不同程度破壞，且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，Arg脫氨c、酶水解：不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸，但需多種酶協(xié)同作用優(yōu)點(diǎn):不破壞任何氨基酸缺點(diǎn):水解不徹底最常見的蛋白水解酶有以下幾種：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶蛋白質(zhì)變性變性是指蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，使蛋白質(zhì)分子原有的特定的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的改變，肽鏈從緊密有序結(jié)構(gòu)→松散無序的結(jié)構(gòu)變性因素：化學(xué)：酸、堿、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑（尿素、鹽酸胍）、重金屬鹽等物理：加熱、紫外線、X-射線、超聲波、劇烈震蕩等變性蛋白質(zhì)的主要特征蛋白質(zhì)分子中次級鍵斷裂，構(gòu)象破壞，但不涉及共價(jià)鍵的破壞，一級結(jié)構(gòu)不變，一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露，可滴定基團(tuán)增加，生物活性全部或部分喪失一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變：變性蛋白質(zhì)的溶解度降低、擴(kuò)散系數(shù)減小而粘度增加蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)除去變性因素后，有的變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性。蛋白質(zhì)的分離和純化總目標(biāo)：增加制品的純度（purity）或比活力(specificacivity),以增加單位蛋白質(zhì)重量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性，設(shè)法除去變性的或不要的蛋白質(zhì)，并且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值一般可以分為前處理、粗分級分離和細(xì)分級分離3步1）目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離純化程序主要包括:1、材料的選擇；2、組織勻漿或高壓破碎細(xì)胞獲取粗提取液；3、蛋白質(zhì)初步提純；4、選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白,直至完全純化；5、目標(biāo)蛋白的鑒定。在目標(biāo)蛋白質(zhì)的整個(gè)分離純化過程中要在較低溫度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶的抑制劑，避免使用劇烈條件。主要分離方法凝膠色譜法（也稱分子排阻色譜）：根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效方法之一等電點(diǎn)沉淀法：蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，容易聚集形成沉淀。鹽溶：中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。鹽析：當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度開始下降。當(dāng)溶解度增加到足夠高時(shí)，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象叫鹽析。鹽析作用主要是蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，水化層被破壞和表面電荷被中和，發(fā)生沉淀。常用的鹽為硫酸銨。隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)疏水表面進(jìn)一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀。因此最先沉淀的是蛋白質(zhì)表面疏水殘基最多的蛋白質(zhì)。e、離子交換色譜法：常用的是陽離子交換樹脂，具有帶負(fù)電荷的固定相和帶正電荷的交換相，帶正電荷的蛋白質(zhì)顆粒與H+進(jìn)行離子交換而被吸附在樹脂上。正電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強(qiáng)，正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液洗脫（如NaCl），通過Na+的離子交換作用，分離帶不同電荷的蛋白質(zhì)f、電泳法：根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同，所帶電荷不同，來分離不同的蛋白蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序(sequence)，一級結(jié)構(gòu)的主要連接鍵是肽鍵，通常將二硫鍵也歸屬于一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的序列具有方向性，一般書寫順序是從N-端到C-端，其主要作用是決定蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定步驟1蛋白質(zhì)中肽鏈的拆離(亞基與分子間二硫鍵)2肽鏈分子內(nèi)二硫鍵的斷裂3肽鏈氨基酸組成分析4氨基酸末端分析5肽鏈的部分降解及肽片斷的分離6肽段氨基酸組成分析及末端分析7肽段序列重疊8二硫鍵的定位蛋白酶的水解專一性：胰蛋白酶(trypsin)：只斷裂Lys、Arg殘基的羧基參與形成的肽鍵胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶,chymotrypsin)：只斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵。胃蛋白酶(pepsin)：與胰凝乳蛋白酶類似，要求斷裂點(diǎn)兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸9、4種羧肽酶的來源和專一性蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中多肽鏈主鏈自身盤繞折疊形成的在一維方向上有規(guī)律性的結(jié)構(gòu)基本類型：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則結(jié)構(gòu)穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵α-螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：(1)肽鍵平面為單位,以-碳原子為轉(zhuǎn)折盤旋形成右手螺旋，螺旋的每圈有3.6個(gè)氨基酸，螺旋間距離為0.54nm，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100，上升0.15nm(2)主鏈原子構(gòu)成螺旋的主體,側(cè)鏈在其外部，直徑約為0.5nm(3)每個(gè)肽鍵的羰基氧與遠(yuǎn)在第四個(gè)氨基酸氨基上的氫形成氫鍵(共形成n-4個(gè)氫鍵)，所有肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成，氫鍵的方向與中心軸大致平行,具有偶極距，是穩(wěn)定螺旋的主要作用力(4)Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，經(jīng)常出現(xiàn)在-螺旋的端頭，它改變多肽鏈的方向并終止螺旋（2）β-折疊由兩條或者多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而成的鋸齒狀的折疊構(gòu)象。常為兩條或兩條以上伸展的多肽鏈側(cè)向聚集在一起形成扇面狀，故又稱β-折疊片或β-片層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1)相鄰肽鍵平面的夾角為110，呈鋸齒狀排列；側(cè)鏈Ｒ基團(tuán)交錯(cuò)地分布在片層平面的兩側(cè)(２)２～５條肽段平行排列構(gòu)成，肽段之間可順向平行(均從N-C)，也可反向平行(３)由氫鍵維持穩(wěn)定，其方向與折疊的長軸接近垂直(3)β-轉(zhuǎn)角肽鏈出現(xiàn)180回折的轉(zhuǎn)角處結(jié)構(gòu)稱為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：第一個(gè)殘基的C=O與第四個(gè)殘基的N-H形成氫鍵，常見于連接反平行β-折疊片的端頭(如Gly與Pro)，多位于球狀蛋白質(zhì)分子表面，約占全部殘基的四分之一無規(guī)卷曲（Randomcoil）沒有確定規(guī)律性的肽鍵構(gòu)象特點(diǎn)：常見于球狀蛋白質(zhì)分子中，在其它類型二級結(jié)構(gòu)肽段之間起連接作用，有利于整條肽鏈盤曲折疊結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域通常是幾個(gè)超二級結(jié)構(gòu)的組合，對于較小的蛋白質(zhì)分子，結(jié)構(gòu)域與三級結(jié)構(gòu)等同，即這些蛋白為單結(jié)構(gòu)域；較大的蛋白質(zhì)分子或亞基往往由兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)域締合而成三級結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力肽鍵，共價(jià)鍵，維系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)二硫鍵，共價(jià)鍵，維系蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)次級鍵，非共價(jià)鍵，維系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)次級鍵的種類：氫鍵、疏水相互作用、離子鍵和范德華力穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力氫鍵對維持二級結(jié)構(gòu)特別重要；疏水作用對維持三級結(jié)構(gòu)特別重要。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的其它特點(diǎn)：1、許多在一級結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的氨基酸堿基在三級結(jié)構(gòu)上相距很近。2、三級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性所必須的。3、所有具有高度生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)幾乎都是球狀蛋白。4、球狀蛋白的三級結(jié)構(gòu)很密實(shí)，大部分的水分子從球形蛋白的核心中被排出，這使得極性基團(tuán)間以及非極性基團(tuán)間的相互用成為可能。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(Quaternarystructure)許多蛋白質(zhì)是由兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立的球狀蛋白質(zhì)通過非共價(jià)鍵結(jié)合成的多聚體，稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每個(gè)獨(dú)立的球狀蛋白質(zhì)稱為亞基（subunit），亞基一般由一條肽鏈構(gòu)成，也稱為單體（monomer）。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)是指亞基的種類、數(shù)量以及各個(gè)亞基在寡聚蛋白質(zhì)中的空間排布和亞基間的相互作用。四級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)：亞基單獨(dú)存在時(shí)無生物活性，只有相互聚合成特定構(gòu)象時(shí)才具有完整的生物活性亞基之間以非共價(jià)鍵結(jié)合，容易彼此解離一級結(jié)構(gòu)規(guī)定了亞基間的結(jié)合方式，四級結(jié)構(gòu)的形成遵從“自我裝配”的原則大多數(shù)寡聚蛋白質(zhì)分子的亞基的排列是對稱的，對稱性是四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)最重要的性質(zhì)之一第二部分酶1、酶：具有催化能力的生物大分子，包括蛋白質(zhì)、核酸等。酶促反應(yīng)：酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)。底物：在酶催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)酶促反應(yīng)的特點(diǎn)：酶促反應(yīng)具有高效性;酶促反應(yīng)具有高特異性;酶促反應(yīng)具有溫和性酶的命名1）習(xí)慣命名法以酶的底物和反應(yīng)類型命名，有時(shí)還加上酶的來源。2）系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。酶的分類：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、合成酶；+1（核酸酶）酶的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)某些RNA有催化活性酶的結(jié)構(gòu)類別組成分類法：單純蛋白質(zhì)酶類+結(jié)合蛋白質(zhì)酶類（酶蛋白質(zhì)+輔因子（金屬離子、金屬有機(jī)物、小分子有機(jī)物））特征分類法：單體酶+寡聚酶+多酶復(fù)合體結(jié)合酶（全酶）=酶蛋白+輔因子酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分（底物專一性）酶的催化類型主要決定于輔因子（反應(yīng)專一性）維生素大多數(shù)輔酶的前體是維生素，主要是水溶性B族維生素維生素一般習(xí)慣分為脂溶性和水溶性兩大類。其中脂溶性維生素在體內(nèi)可直接參與代謝的調(diào)節(jié)作用，而水溶性維生素是通過轉(zhuǎn)變成輔酶對代謝起調(diào)節(jié)作用。脂溶性維生素：維生素A,D,E,K均溶于脂類溶劑，不溶于水，在食物中通常與脂肪一起存在，吸收它們，需要脂肪和膽汁酸。酶分子的結(jié)構(gòu)活性中心或活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。結(jié)合基團(tuán)，與底物進(jìn)行結(jié)合；催化基團(tuán)，將底物進(jìn)行催化。組成酶活性中心的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)主要有Glu和Asp的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的側(cè)鏈基團(tuán)7種AA頻率最高：Ser,His,Cys,Tyr,Asp,Glu和LysB、酶的必需基團(tuán)(essentialgroup):參與構(gòu)成酶的活性中心和維持酶的空間構(gòu)象所必需的基團(tuán)這些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失。活性中心的特點(diǎn)：活性部位在酶分子的總體中只占相當(dāng)小的部分，通常只占整個(gè)酶分子體積的1%~2%酶的活性部位是一個(gè)三維實(shí)體酶活性部位的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性酶活性部位的位置酶的活性部位位于酶分子表面的一個(gè)裂縫(Crevice)內(nèi)，底物分子(或一部分)結(jié)合到裂縫內(nèi)并發(fā)生催化作用酶活性部位的柔性或可運(yùn)動(dòng)性酶和底物之間的作用力酶與底物之間通過次級鍵相互識別和結(jié)合，如氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用研究酶活性部位的方法1、切除法應(yīng)用專一性蛋白水解酶將酶分子的肽鏈切除一部分，然后測定其剩余部分的活性。酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法(共價(jià)修飾)酶活性中心氨基酸殘基所含的官能團(tuán)如巰基、羥基、咪唑基、氨基、羧基和胍基等是多種酶活性中心的必需基團(tuán)，當(dāng)這些基團(tuán)被化學(xué)修飾后，酶的催化活性將降低甚至消失3、X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析法4、定點(diǎn)突變法(site-directedmutagenesis)根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究結(jié)果，采用定點(diǎn)突變技術(shù)改變編碼蛋白質(zhì)基因中的DNA序列，研究酶活性部位的必需氨基酸酶的分離、純化和活力的測定酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力，可以用酶促反應(yīng)速度來表示，兩者呈線性關(guān)系。酶促反應(yīng)速度：以單位時(shí)間底物濃度的減少或產(chǎn)物濃度的增加來表示。測定酶活力時(shí)，為了保證所測定的速率是初速率，以底物濃度的變化在起始濃度的5%（或小于10%）以內(nèi)的速率為初速率在測定酶活力的時(shí)候，往往使底物濃度足夠大，這樣整個(gè)酶反應(yīng)對底物來說是零級反應(yīng)，對酶來說是一級反應(yīng)，這樣測得的速率就比較可靠地反映酶的含量。酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（turnovernumber,TN,等于催化常數(shù)Kcat）是指一定條件下單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的個(gè)數(shù)。大多數(shù)酶對它們天然底物的轉(zhuǎn)換數(shù)的變化范圍為1-10000/s酶的比活力（specificactivity）：酶學(xué)研究及生產(chǎn)中經(jīng)常使用，指每mg蛋白所含的酶活力單位數(shù)。比活力大小可以代表酶的純度，對同一種酶，比活力越大，酶的純度越高；比活力大小也可用來比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力,對同一種酶，比活力越大，酶催化能力越強(qiáng)。比活力(U/mg)=總活力/酶總量回收率和純化倍數(shù)回收率=每次總活力/第一次總活力純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力6）酶的分離、純化需要注意的幾點(diǎn)是：（1）選材（2）盡可能低溫操作(0～4℃)（3）在分離提純過程中，不能劇烈攪拌（4）提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo(hù)劑如加少量EDTA、β-巰基乙醇或蛋白酶抑制劑PMSF。為什么？加少量EDTA防止重金屬對酶的破壞；含巰基的酶提取中加少量β-巰基乙醇可防止被氧化；加入少量蛋白酶抑制劑PMSF等防止內(nèi)源蛋白酶對酶的水解作用。酶作用機(jī)制酶催化作用的本質(zhì)是酶的活性中心與底物分子通過短程非共價(jià)力(如氫鍵,離子鍵和疏水鍵等)的作用，形成ES過渡態(tài)，使底物的價(jià)鍵狀態(tài)發(fā)生形變或極化，激活底物分子和降低過渡態(tài)活化能。酶高效催化的機(jī)理鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)酶的作用動(dòng)力學(xué)（kinetics）影響酶促反應(yīng)速度的因素：底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑、抑制劑。米氏方程V:反應(yīng)速率，Vmax:酶完全被底物飽和時(shí)的最大反應(yīng)速率[S]:底物濃度Ks:ES的解離常數(shù)在底物濃度低時(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應(yīng)特征；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值時(shí)，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速率達(dá)到最大值，此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速率不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)；當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到最大速率一半時(shí)，Km=[S]，即米式常數(shù)是反應(yīng)速率達(dá)到最大速率一半時(shí)的底物濃度，單位為mol/L。Km是酶的一個(gè)特征物理常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)，通過測定Km值可以鑒別酶如果一種酶能催化幾種不同的底物，對每種底物都有一個(gè)特定的Km值，其中Km值最小的稱該酶的最適底物Km與Ks：Km不等于Ks(Ks=[ES]/[E][S])，只有在特殊情況下即:k2>>k3，Km=Ks。在Km=Ks時(shí)，Km可表示酶和底物的親和力，Km越小，E對S的親合力越大，Km越大，E對S的親合力越小。米氏常數(shù)的求法雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk作圖法）激活劑對酶反應(yīng)速度的影響凡是能提高酶活性的物質(zhì)，稱為酶的激活劑（activator）抑制劑對酶作用的影響凡使酶的某些基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而導(dǎo)致酶的催化活性降低或喪失的物質(zhì)，叫酶的抑制劑（inhibitor）抑制劑使酶的催化活性降低或喪失而不引起酶蛋白變性的作用稱為抑制作用（inhibition）酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似b.能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物類型：不可逆抑制作用；可逆抑制作用(1)不可逆抑制作用定義：抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合而使酶活性喪失，不能通過透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活。由于被抑制的酶分子受到不同程度的化學(xué)修飾，故不可逆抑制也就是酶的修飾抑制可逆抑制作用定義：抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合而引起酶活力降低或喪失，能通過透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活競爭性抑制作用

可逆抑制作用非競爭性抑制作用

反競爭性抑制作用

競爭性抑制作用

可逆抑制作用非競爭性抑制作用

反競爭性抑制作用

競爭性抑制作用定義：抑制劑(I)和底物(S)競爭酶的結(jié)合部位，從而影響底物與酶的正常結(jié)合B、非競爭性抑制作用定義：抑制劑和底物同時(shí)與酶分子結(jié)合，兩者沒有競爭作用C、反競爭性抑制作用定義：酶只有與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，即ES+IESI,ESIP。反競爭性抑制作用多見于多底物反應(yīng)中，而在單底物反應(yīng)中比較少見?？赡嬉种谱饔脛?dòng)力學(xué)(1)競爭性抑制雙倒數(shù)式：有競爭性抑制劑存在時(shí)，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值隨[I]的增高而增大；在[E]固定時(shí)，當(dāng)[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)項(xiàng)可忽略不計(jì)，則v=Vmax，即最大反應(yīng)速度不變非競爭性抑制作用的速度方程 有非競爭性抑制劑存在時(shí)，v值減小(1+[I]/Ki)倍，且v值隨[I]的增高而降低；Km值不變。反競爭性抑制作用動(dòng)力學(xué)方程討論動(dòng)力學(xué)方程: 附：同工酶：催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶第三部分核酸核酸的發(fā)現(xiàn)1868年，瑞士青年科學(xué)家米歇爾(F．Miescher)從包裹傷口繃帶的膿細(xì)胞的細(xì)胞核中提取到一種可溶于稀堿而不溶于稀酸，并含磷量之高超過任何當(dāng)時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有機(jī)化合物的強(qiáng)酸性物質(zhì),當(dāng)時(shí)就稱它為核素（nuclein）核酸的種類、分布和特點(diǎn)DNA:通過復(fù)制傳遞遺傳信息至子代,主要的遺傳物質(zhì)環(huán)狀雙鏈DNA:原核生物染色體、細(xì)胞器及質(zhì)粒DNA線型雙鏈DNA:真核核內(nèi)染色體DNA病毒DNA有環(huán)狀、線性、單鏈、雙鏈之分RNA:轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA):翻譯氨基酸,轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖核蛋白體信使RNA(mRNA):將DNA遺傳信息傳遞到核糖核蛋白體核糖RNA(rRNA):核糖核蛋白體主要部分,參與蛋白合成核酸的組成：成分：堿基，戊糖，磷酸；單位（結(jié)構(gòu)單元）：核苷酸核酸的結(jié)構(gòu)：一）核酸的一級結(jié)構(gòu)由四種不同的核苷酸單元按特定核苷酸順序（堿基順序）組合而成的線性結(jié)構(gòu)聚合物。核酸的堿基順序是核酸的一級結(jié)構(gòu)。5、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)(1)主鏈(backbone)：由脫氧核糖和磷酸基通過酯鍵交替連接而成。主鏈有二條,相互平行而走向相反,圍繞同一中心軸形成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。堿基平面與縱軸垂直，磷酸與核糖在外側(cè)，糖環(huán)平面與縱軸平行，雙螺旋就是針對二條主鏈的形狀而言的。(2)堿基對(basepair)：位于螺旋的內(nèi)側(cè),垂直于螺旋軸通過糖苷鍵與主鏈糖基相連。同一平面的堿基在二條主鏈間形成堿基對。DNA結(jié)構(gòu)中的堿基對與Chatgaff的發(fā)現(xiàn)正好相符。兩條鏈通過堿基配對，由疏水作用和氫鍵維系在一起，A與T，G與C結(jié)合，由一條鏈通過堿基互補(bǔ)決定另一條鏈。(3)大溝和小溝：雙螺旋表面凹下去的較大和較小溝槽。(4)結(jié)構(gòu)參數(shù)：雙螺旋平均直徑為2nm，相鄰堿基對平面的間距0.34nm，兩核苷酸間夾角為36，每一圈10對核苷酸，螺距為3.4nm(5)堿基在一條鏈上的排列順序不受任何限制。但根據(jù)堿基配對原則，當(dāng)一條多核苷酸鏈的序列被確定后可決定另一條互補(bǔ)連的序列。表明遺傳信息由堿基的序列所攜帶6、穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵（1）互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵（2）雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成的疏水區(qū)，消除了介質(zhì)中水分子對堿基之間氫鍵的影響。（3）堿基堆積力包括疏水作用力和范德華力（4）磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子之間形成的離子鍵，降低了DNA鏈之間的排斥力7、比較蛋白質(zhì)α-螺旋和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，包括它在穩(wěn)定這兩種結(jié)構(gòu)中的作用

在蛋白質(zhì)多肽鏈α-螺旋中多肽主鏈上羰基氧與酰胺基的氫之間形成氫鍵，大體上與螺旋軸平行。殘基的側(cè)鏈從主鏈中伸出，不出現(xiàn)在螺旋內(nèi)，不參與螺旋內(nèi)的氫鍵形成。螺旋中眾多氫鍵累積可穩(wěn)定螺旋的結(jié)構(gòu)，特別是蛋白質(zhì)疏水的內(nèi)部，沒有水分子競爭氫鍵的形成。在DNA分子中，氫鍵的形成不涉及糖-磷酸骨架，大體上與螺旋軸垂直，每個(gè)堿基對可形成兩個(gè)或三個(gè)氫鍵。允許一條鏈對另一條鏈起模板的作用，堿基堆積力對螺旋的穩(wěn)定作用更大8、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義

揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征確認(rèn)了堿基配對原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)9、雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)DNA和基因的關(guān)系DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。.非共價(jià)鍵有哪幾種？論述這些非共價(jià)鍵在穩(wěn)定核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)象中的重要作用非共價(jià)鍵主要有氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水相互作用氫鍵：氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。氫鍵是維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的橫向作用力。離子鍵：在生理pH下，蛋白質(zhì)中酸性氨基酸的側(cè)鏈可解離成負(fù)離子，堿性氨基酸的可解離成正離子。在大多數(shù)情況下這些氨基酸殘基都分布在球狀蛋白質(zhì)分子的表面，與介質(zhì)水分子發(fā)生電荷-偶極之間的相互作用，形成排列有序的水化層，這對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象有一定的作用。在生理?xiàng)l件下，DNA帶有大量的負(fù)電荷，吸引著各種陽離子如多胺、組蛋白、Mg2+等形成離子鍵，消除了自身各部位之間因負(fù)電荷而產(chǎn)生的斥力，增加了DNA分子的穩(wěn)定性。疏水相互作用：水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋在分子內(nèi)部，疏水相互作用是穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)的主要作用力。DNA中芳香堿基的π電子之間相互作用，使堿基發(fā)生締合，堿基有規(guī)律層層堆積，在DNA內(nèi)部形成一個(gè)疏水核心區(qū)，有助于氫鍵形成，是維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的縱向作用力。范德華力：包括吸力和斥力。非共價(jià)鍵結(jié)合原子或分子相互靠得太近時(shí)產(chǎn)生斥力；非共價(jià)鍵結(jié)合原子處于一定距離時(shí)范德華吸力會(huì)達(dá)到最大。范德華力相互作用數(shù)量大且具有加和效應(yīng)和位相效應(yīng)，是穩(wěn)定蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)象不可忽視的一種作用力12、DNA雙螺旋模型建立的重要意義在于：A.證明了遺傳物質(zhì)是DNA，而不是蛋白質(zhì)B、揭示了DNA的結(jié)構(gòu)奧秘，為解決“DNA是如何遺傳的”這一難題提供了依據(jù)C、表明DNA的兩條鏈反向平行排列，呈右手螺旋結(jié)構(gòu)D、表明DNA的3個(gè)連續(xù)的核苷酸組成1個(gè)遺傳密碼核酸的性質(zhì)：DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物大都呈酸味，肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。DNA溶液的粘度很大，抗剪切力差，而RNA溶液的粘度小得多。核酸發(fā)生變性或降解后其粘度降低。加熱條件下，D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色14、核酸的變性和復(fù)性與分子雜交1）、變性穩(wěn)定核酸雙螺旋的次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。變性表征生物活性部分或