第1章 基因工程的基本概念 yu

云南大學2015春季必修課程基因工程云南大學余敏Emailyumin@

生命科學與生物技術(shù)的理論體系研究對象研究層次量子分子細胞組織個體群體細菌真菌病毒植物動物人類遺傳生理生物生態(tài)仿生分子生物學細胞生物學化學工程生命科學生物工程生物技術(shù)研究內(nèi)容生命科學理論與技術(shù)3

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細胞生物學基礎(chǔ)分子免疫學基礎(chǔ)生物技術(shù)與生物工程2

分子生物學基礎(chǔ)細胞生物學基礎(chǔ)A細胞的結(jié)構(gòu)與功能B細胞的分裂與增殖C細胞的衰老與凋亡D細胞的生長與分化E細胞的物質(zhì)運輸F細胞的信號傳遞分子生物學基礎(chǔ)分子生物學的三大基本內(nèi)容：生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能（結(jié)構(gòu)分子生物學）基因的表達和調(diào)控機制（中心法則）分子生物學實驗技術(shù)（實驗分子生物學）遺傳信息傳遞的中心法則DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白質(zhì)生物代謝物質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯代謝基因組學轉(zhuǎn)錄組學蛋白組學代謝組學逆轉(zhuǎn)錄生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能DNA（基因）蛋白質(zhì)多糖指導(dǎo)合成關(guān)系核酸脂類相互作用關(guān)系基因工程5

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基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動物基因工程高等植物基因工程D基因工程的基本形式1基因工程的基本概念C重組DNA技術(shù)與基因工程的基本用途B基因工程的基本定義A重組DNA技術(shù)的基本定義E

基因工程的發(fā)展A重組DNA技術(shù)的基本定義1基因工程的基本概念

重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。B基因工程的基本定義1基因工程的基本概念

基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。C重組DNA技術(shù)與基因工程的基本用途1基因工程的基本概念分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)工程細胞基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程發(fā)酵工程細胞工程分離工程酶酶工程分離工程天然細胞天然細胞生物活性物質(zhì)有多個術(shù)語表述基因工程：基因工程（geneengineering）;遺傳工程（geneticengineering）;基因操作（genemanipulation）;重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique）;基因克隆（geneclone）;分子克?。╩olecularclone）等等。現(xiàn)在人們的基因工程，主要是強調(diào)通過基因操作，改變生物的性狀，獲得人類需要的某些產(chǎn)品或生物性狀。D基因工程的基本形式1基因工程的基本概念第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表達經(jīng)典基因工程第二代基因工程蛋白編碼基因的定向誘變蛋白質(zhì)工程第三代基因工程代謝信息途徑的修飾重構(gòu)途徑工程

第四代基因工程基因組或染色體的轉(zhuǎn)移基因組工程現(xiàn)代生物工程技術(shù)蛋白質(zhì)工程細胞組織工程酶工程發(fā)酵工程基因工程1基因工程的基本概念

基因工程在現(xiàn)代生物工程技術(shù)中的地位蛋白質(zhì)工程的概念

在利用基因工程技術(shù)了解編碼蛋白質(zhì)的基因的基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能進行分析;進而通過對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列的改造和翻譯后的修飾等手段，改變甚至創(chuàng)造出新的和更有效的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)功能預(yù)測和分析蛋白質(zhì)組分析細胞（組織）工程概念組織工程：利用移植的細胞、骨架、DNA、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段替代或修復(fù)已受傷或損壞的組織和器官生物加工工程：利用活細胞生產(chǎn)生物醫(yī)藥產(chǎn)品組織工程——人造器官王正敏

干細胞：1999年4月，美國的科研人員首次成功地從成年人骨髓的干細胞在體外培養(yǎng)分化出軟骨、脂肪和骨骼細胞。標志著干細胞的研究取得了重大進展。以這項技術(shù)為代表的組織工程的突破具有廣闊的應(yīng)用前景，在不遠的將來為實現(xiàn)人造“器官”成為可能。酶工程的概念是酶學與工程學的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來，以酶為研究對象，改造并應(yīng)用酶的特異催化功能。目標就是通過工程化技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化相應(yīng)原料成為有用物質(zhì)的技術(shù)

酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化酶與細胞的固定化技術(shù)及反應(yīng)器酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)酶分子化學修飾、遺傳突變及結(jié)構(gòu)改造酶抑制劑與激活劑開發(fā)與研究人工設(shè)計與合成模擬酶及酶分子發(fā)酵工程

發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的下游技術(shù)，是工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細胞、生產(chǎn)生物制品的一種技術(shù)。傳統(tǒng)的發(fā)酵工程主要用于微生物。現(xiàn)代生物技術(shù)還包括動物、植物細胞和工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

1、基因工程理論基礎(chǔ)—三大理論發(fā)現(xiàn)（1）20世紀40年代：證明了遺傳物質(zhì)是DNA

1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗20世紀20-30年代確認自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成1944年O.T.Avery肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分別標記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌（一）基因工程的誕生

E基因工程的發(fā)展

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗有莢膜（S型）無莢膜（R型）非致?。?）1953年Watson和Crick：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（3）1958～1971年：先后確立中心法則,破譯64種密碼子，揭示了遺傳信息的流向和表達確定了遺傳信息的傳遞方式

B技術(shù)上的3大發(fā)明：

1．“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)明

（1）20世紀40－60年代，科學家們就為基因工程設(shè)計了美好的藍圖，但是面對龐大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手無策，無從下手把它切成單個基因片斷。（2）當時的酶學知識已有相當?shù)陌l(fā)展，但是沒有一個已發(fā)現(xiàn)的酶能完成這樣的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌（Haemophilusinffuenzae）分離純化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來了改造生物的春天，為基因工程奠定了最為重要的技術(shù)基礎(chǔ)。RestrictionenzymerestrictionendonucleaseenzymethatcutsDNAstrandsatspecificsitesLigaseenzymeusedtojointwopiecesofDNA

2．載體(“交通工具車子”)－基因工程技術(shù)誕生的第二個技術(shù)準備

（1）

有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個載體將重組DNA送到宿主細胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究細菌性因子（F因子）.50-60年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥因子），CoE(大腸桿菌因子)等質(zhì)粒。（3）1972年Berg首次實現(xiàn)基因重組(將SV40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功)----第一個重組DNA分子，1980年諾貝爾化學獎1973年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個技術(shù)準備。vectoranagentsuchasaplasmidusedtotransferDNAintoahostcellImportanceofE.coliThe“l(fā)aboratorymouse”ofbacteriaUsedingeneticengineering

3．逆轉(zhuǎn)錄酶－1970年Baltimove和Temin等同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學（生物學）中心法則，使真核基因的制備成為可能。（？？？）(1)真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。HGP2005年完成，2.8萬個基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內(nèi)含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。

1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer----標志著基因工程的誕生。NerNerNer第一個轉(zhuǎn)化成功的重組DNA

基因工程的發(fā)展E基因工程的發(fā)展1976年等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子somatostatin14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中表達1977年美國南舊金山由Boyer和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學上重要的藥物。1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達成功1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因（HGH）重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素1980年，美國/瑞士人，a干擾素－基因；1984年，日本人，白細胞介素2（IL-2）；（三）基因工程的騰飛1980年：顯微注射培育出第一個轉(zhuǎn)基因動物—轉(zhuǎn)基因小鼠，1982年，美國，大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠----巨鼠1983年，美國，農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育出第一例轉(zhuǎn)基因植物—轉(zhuǎn)基因煙草1990年，美國，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SDID）1991年，美國倡導(dǎo)，人類基因組計劃109bp，15年時間30億USD；1997年，美國人，威爾英特克隆多利綿羊

基因工程藥物的類型：

1.生長因子，如胰島素，白細胞介素等；

2.活性蛋白因子，如干擾素等；

3.酶類，如鏈激酶，尿激酶等；

4.疫苗，如乙肝疫苗等；

5.抗體，用作治療的人源化抗體；

6.診斷試劑。胰島素人生長激素干擾素白細胞介素2粒細胞集落刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子紅細胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體已上市的基因工程藥物BenefitsofRecombinantBacteria1.Bacteriacanmakehumaninsulinorhumangrowthhormone.2.Bacteriacanbeengineeredto“eat”oilspills.TransgenicorganismsWhenanorganismcontainsgenesfromotherorganisms.Example:AtobaccoplantthatcontaindDNAfromafirefly.TheDNAofplantsandanimals

canalsobealtered.

PLANTSdisease-resistantandinsect-resistantcrops2.Hardierfruit3.70-75%offoodinsupermarketis

geneticallymodified.TransgenicorganismsGenefromArcticcharfishinsertedintotomato=Frost-resistanttomatoTransgenicplantsUsuallycashcropssuchascotton,corn,wheat,soybeans,etc.OftenincorporatesbacterialDNAtomakethecropresistanttodisease,pests,orchemicals.Ex:Btcorn蘇云金芽孢桿菌

HowtoCreateaGenetically

ModifiedPlant1.Createrecombinantbacteriawithdesiredgene.2.Allowthebacteriato“infect"theplantcells.3.Desiredgeneisinsertedintoplantchromosomes.SelectiveBreedingBreedonlythoseplantsoranimalswithdesirabletraitsPeoplehavebeenusingselectivebreedingfor1000’sofyearswithfarmcropsanddomesticatedanimals.GeneticallymodifiedorganismsarecalledGMOTRANSGENICANIMALSMice–usedtostudy