不同大鼠皮膚藥物質(zhì)量濃度與曲線圖研究酮康唑凝膠經(jīng)正常大鼠和糖尿病大鼠皮膚透過性的差異

不同大鼠皮膚藥物質(zhì)量濃度與曲線圖研究酮康唑凝膠經(jīng)正常大鼠和糖尿病大鼠皮膚透過性的差異

糖尿?。╩etis）是一種由多種原因引起的慢性代謝性疾病，以高血糖為特征。糖尿病患者皮膚組織的糖原含量增高,容易并發(fā)各種真菌、細菌和病毒感染,在糖尿病的各個時期,可出現(xiàn)多種皮膚病變,糖尿病患者罹患皮膚病的比例約占25%～30%。酮康唑(ketoconazole,KTZ)為化學(xué)合成吡咯類抗真菌藥,具廣譜抗真菌作用,對全身真菌感染、深部真菌感染、表皮真菌感染均有效。酮康唑口服可引起多種毒副作用,如肝毒性、胃腸道反應(yīng)等,目前主要以外用為主。微透析技術(shù)是將灌流取樣和透析技術(shù)結(jié)合起來的一種新型生物采樣技術(shù),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥物代謝、毒理、藥動學(xué)、行為神經(jīng)化學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)等領(lǐng)域,具有樣品純凈、不需要做前處理的優(yōu)點,是目前研究活體藥物組織分布、藥物組織穿透力及監(jiān)測藥物有效濃度的可靠方法。糖尿病患者皮膚與健康人皮膚在使用酮康唑經(jīng)皮給藥制劑時是否存在差異性,目前尚未見文獻報道。本文采用微透析(microdialysis)技術(shù)對酮康唑凝膠經(jīng)正常大鼠和糖尿病大鼠皮膚透過性的差異進行研究,以期對酮康唑的臨床應(yīng)用提供參考。1儀器和試劑1.1gc/ms色譜條件OneTouchUltra2血糖儀及試紙(美國強生公司生產(chǎn));SevenMulti酸度計(METTLERTOLEDO生產(chǎn));PB110S電子天平(德國Sartorins公司);Agilent1200Series液相色譜儀,Agilent6460三重四極桿液相色譜/質(zhì)譜,AgilentMassHunter色譜管理系統(tǒng)(美國Agilent公司);BG型超純水儀(美國托普儀器有限公司);微透析設(shè)備:CMA/402微透析泵、微量注射器(1.0mL及2.5mL規(guī)格)、CMA20Elite同心環(huán)形微透析探針(簡稱Y型探針,OD500μm,活性透析膜長度為10mm,分子質(zhì)量截留值為20ku,瑞典CMA公司)。1.2檢定所和標(biāo)準(zhǔn)表鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ,Sigma公司);酮康唑?qū)φ掌?中國藥品與生物制品檢定所,批號100294-200602);酮康唑凝膠(自制,質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%,廣州越迪化工有限公司分裝);內(nèi)標(biāo)為地西泮(DZP,Sigma公司);高效液相試劑甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;枸櫞酸、枸櫞酸三鈉均為分析純;水為雙蒸去離子水;其他試劑均為分析純。1.3實驗動物中心提供SPF級雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量(230±10)g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號為SCXK(粵)2006-0015。2方法2.1造模、注射及結(jié)果將20只SPF級雄性Wistar大鼠用常規(guī)飼料喂養(yǎng)2周后,禁食12h,于次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下測血糖濃度(bloodglucoseconcentration,BGC),剔除血糖過高(>6mmol·L-1)或偏離正常值較大的動物。稱質(zhì)量,選取12只隨機分為2組,每組6只,分別為正常對照組和糖尿病模型組(DM組),DM組大鼠一次性腹腔注射用0.1mol·L-1(pH4.4)枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液溶解的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%STZ進行造模,注射劑量45mg·kg-1,正常對照組大鼠單次腹腔注射等體積的0.1mol·L-1(pH4.4)枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。注射后3、7、14、28d分別用美國強生血糖儀測尾尖血糖,以血糖>16.7mmol·L-1作為糖尿病成型標(biāo)準(zhǔn)。2.2丙酮醇lc-ms和ms檢測方法的建立2.2.1對照品儲備液的制備灌流液(Ringer液)的配制:將NaCl7.5g、KCl0.2g、CaCl20.4g,用蒸餾水溶解并稀釋至1000mL,得Ringer液,每次需用0.22μm濾器濾過后再使用。酮康唑甲醇液的配制(供建立質(zhì)譜方法用):精密稱取酮康唑?qū)φ掌?.001g,用甲醇溶解并稀釋,定容至100mL,得10mg·L-1的酮康唑?qū)φ掌穬湟?。?nèi)標(biāo)甲醇溶液的配制:將購得的1mg·mL-1地西泮甲醇溶液用甲醇稀釋至100ng·mL-1備用。2.2.2苯甲酸-乙腈條件色譜條件:色譜柱為Agilent,ZORBAX-C18色譜柱(4.6mm×50mm,1.8μm);流動相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈(體積比30∶70);流速為0.3mL·min-1;進樣量為10μL;柱溫為30℃。質(zhì)譜條件:采用電噴霧二級質(zhì)譜,ESI源,使用全掃描一級質(zhì)譜(MS2Scan),正離子檢測,多重反應(yīng)檢測模式(MRM),脫溶劑溫度為350℃,脫溶劑氣流速為11L·min-1,裂解電壓、碰撞能量、掃描離子片段等參數(shù)見表1。2.2.3特征液質(zhì)及色譜圖取頸靜脈與腹部皮下空白基質(zhì)灌流液、酮康唑溶液和內(nèi)標(biāo)灌流液、加了內(nèi)標(biāo)的微透析樣品溶液,分別依法測定,酮康唑特征液質(zhì)圖譜見圖1?？梢?空白基質(zhì)譜圖中,頸靜脈及皮下基質(zhì)中均未檢測到藥物,說明無干擾(圖1A、B);酮康唑出峰時間約為1.8min(圖1C),地西泮出峰時間約為3.4min(圖1D);微透析頸靜脈樣品加入內(nèi)標(biāo)后,酮康唑與內(nèi)標(biāo)完全分離(圖1E)。2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取酮康唑儲備液,用空白灌流液稀釋,分別配制1、5、10、25、50、100、250、500、1000、2000、3000、4000、5000ng·mL-1酮康唑系列溶液,每個質(zhì)量濃度精密量取45μL,加入7.5μL內(nèi)標(biāo)后,進樣10μL測定,以酮康唑和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為橫坐標(biāo),樣品中酮康唑質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=901.74X+1.59(r2=0.9957),線性范圍為1～5000ng·mL-1。當(dāng)信噪比S/N=5時,確定最低定量限為1ng。2.2.5方法的精密度按“2.2.4”項下方法分別配制低、中、高(5、1000和4000ng·mL-1)3個質(zhì)量濃度的樣品,在1d內(nèi)測定5份樣品,計算日內(nèi)精密度,每日測定1份樣品,重復(fù)測定5d,計算日間精密度。結(jié)果測得低、中、高3個質(zhì)量濃度的樣品溶液的日內(nèi)精密度RSD值分別為3.46%、0.92%、0.93%,日間精密度RSD值分別為3.62%、0.78%、1.03%,RSD值均<3.62%,說明本方法精密準(zhǔn)確,符合相關(guān)要求。2.2.6基質(zhì)對藥物檢測的影響同時考察頸靜脈和腹部皮下樣品的基質(zhì)效應(yīng)。選低、中、高(5、1000、4000ng·mL-1)3個質(zhì)量濃度的樣品,各取0.1mL溶液分別加入小EP管中,分別加入頸靜脈空白基質(zhì)、皮下空白基質(zhì)及空白灌流液10μL,渦旋混合均勻,每種基質(zhì)每個質(zhì)量濃度各做3個樣本,基質(zhì)與空白灌流液樣品結(jié)果相比,基質(zhì)效應(yīng)都比較接近1,說明基質(zhì)對藥物檢測的影響很小,不影響準(zhǔn)確測定,結(jié)果見表2。2.3在體微析的基礎(chǔ)上2.3.1灌流液的相對損失率測定分別在大鼠頸靜脈和腹部皮下各埋植1支探針,用5000ng·mL-1的KTZ林格液進行灌流,平衡60min左右后開始收集灌流液,45min收集一管,連續(xù)收集5管(每次約45μL)。分別將灌流液和透析液注入色譜儀,測定藥物質(zhì)量濃度,分別記為ρ灌注液和ρ透析液。相對損失率(relativeloss,RL)=(ρ灌注液-ρ透析液)/ρ灌注液×100%。每只大鼠的在體損失率為5個點的均值,共做5只大鼠,計算均值用于微透析實驗結(jié)果的校準(zhǔn)。2.3.2大鼠頸靜脈內(nèi)固定期過流法雄性Wistar大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉(30mg·kg-1)后,仰位固定于鼠板上。用電剃刀除去腹部鼠毛,在腹部皮膚上選擇植入點,用注射器針頭從植入點插入需要采樣的部位及深度,抽出注射器留下套管以固定位置,再將探針?biāo)腿胩坠苤?然后緩慢抽離套管,邊往外拉邊撕除套管,直至整根套管被撕開。整個操作過程,探針中保持1μL·min-1的灌流速度。與此同時,在大鼠右頸部剪開1個0.5cm的切口,鈍性分離頸靜脈,扎閉遠心端,用小手術(shù)剪在血管上剪開1個小口,將探針朝向右心室方向植入頸靜脈中,并用縫合線將探針與頸靜脈結(jié)扎固定,然后取蘸有生理鹽水的棉球遮蔽頸部手術(shù)傷口部位,打開手術(shù)照明燈為大鼠身體保溫。整個操作過程,探針中一直保持1μL·min-1的灌流速度,并在以下的整個實驗中保持不變。待手術(shù)平衡60min左右后,用雙面膠將玻璃給藥器固定于大鼠腹部埋植探針透析膜的皮膚上(給藥器內(nèi)徑約為2cm),加約2g酮康唑凝膠于給藥器中,開始收集透析液,每45min收集1管樣品,連續(xù)取樣12管(9h左右),采用LC-MS/MS法測定樣品中藥物質(zhì)量濃度,用體內(nèi)回收率校正后,繪制藥物的質(zhì)量濃度-時間曲線圖。微透析采集的樣品質(zhì)量濃度經(jīng)回收率校正后即為動物組織中真實的藥物質(zhì)量濃度,此質(zhì)量濃度為采樣間隔時間內(nèi)的平均值,故以采樣間隔的時間中點(middle-pointtime)作為橫坐標(biāo)。2.4藥動學(xué)參數(shù)檢測計量資料統(tǒng)計結(jié)果以ˉx±sxˉ±s表示。正常對照組與DM造模組大鼠造模前及造模后4周血糖及體質(zhì)量采用Prism5.0軟件做圖。微透析測得的皮下和頸靜脈藥物質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)采用Winnonlin軟件計算Cmax、Tmax、AUC等藥動學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)均采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1大鼠體質(zhì)量和血糖造模前,大鼠皮毛光澤油亮、順滑,精神狀態(tài)佳,行動敏捷,糞尿正常。STZ注射1周后,大鼠發(fā)生較明顯變化,精神漸萎靡,活動明顯減少,皮毛干燥粗糙,尿量增多。造模前和造模4周后大鼠體質(zhì)量變化曲線見圖2。可見,造模前2組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);造模后,正常組大鼠體質(zhì)量增加,造模組大鼠體質(zhì)量降低,2組大鼠體質(zhì)量變化有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模前和造模4周后大鼠血糖變化曲線見圖3?？梢?造模前2組血糖均在正常范圍內(nèi),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);造模組血糖有顯著性升高,正常組大鼠血糖基本維持不變,2組大鼠造模前后血糖差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3.2腰椎在體損失率頸靜脈微透析探針在體損失率為(78.17±8.10)%(ˉx±s?n=5)(78.17±8.10)%(xˉ±s?n=5),腹部皮下在體損失率為(54.54±4.48)%(ˉx±s?n=5)(54.54±4.48)%(xˉ±s?n=5)。3.3大鼠臟器正常皮給藥后的藥動學(xué)將測得透析液中的藥物質(zhì)量濃度用在體損失率校正后,所得結(jié)果即為取樣部位的真實藥物質(zhì)量濃度,計算公式為ρ真實=ρ測量/(1-RL)。酮康唑凝膠經(jīng)皮給藥后大鼠腹部皮下的藥物質(zhì)量濃度-時間曲線見圖4,藥動學(xué)參數(shù)見表3?？梢?酮康唑凝膠經(jīng)皮給藥后,糖尿病大鼠腹部皮下組織中的Cmax及AUC明顯高于正常組大鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而Tmax的差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。酮康唑凝膠經(jīng)皮給藥后大鼠頸靜脈中酮康唑質(zhì)量濃度-時間曲線見圖5,藥動學(xué)參數(shù)見表4。可見,酮康唑凝膠經(jīng)皮給藥后,糖尿病大鼠頸靜脈的藥物質(zhì)量濃度-時間曲線與正常大鼠的基本重合,2組大鼠的Cmax、AUC、Tmax差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4stz注射途徑和探針回收率關(guān)于糖尿病大鼠模型是否造模成功的標(biāo)準(zhǔn)并非很明確,只要出現(xiàn)多飲、多食、多尿等現(xiàn)象可認(rèn)為造模成功,也有報道認(rèn)為血糖>11.1mmol·L-1即可認(rèn)定造模成功。本研究采用45mg·kg-1STZ的給藥劑量建立大鼠Ⅰ型糖尿病模型,成功率達到90%以上,相比很多文獻報道的較高劑量,如普遍認(rèn)定的60mg·kg-1,效果同樣顯著。用STZ誘導(dǎo)糖尿病模型,具有造模時間短、發(fā)病時間整齊和病情嚴(yán)重程度較統(tǒng)一等特點,而且這種造模技術(shù)容易掌握。STZ注射途徑有腹腔注射和尾靜脈注射,尾靜脈注射較難掌握,易出現(xiàn)操作誤差,而腹腔注射易操作、準(zhǔn)確、快速。STZ很不穩(wěn)定,遇水極易分解,所以要避光保存及操作,配制時也需要注意在冰浴操作;腹腔給藥時,速度不可過快,否則容易造成大鼠死亡,速度過慢也可能影響造模成功率,應(yīng)在配制STZ溶液后30min內(nèi)完成造模。微透析技術(shù)的關(guān)鍵問題就是如何對取出的樣品進行準(zhǔn)確可靠的校正,這就涉及到對探針的回收率的測定。微透析探針主要由具有一定分子量截留值的半透膜組成,探針回收率是指從灌流液中流出的待測組分與標(biāo)準(zhǔn)濃度之比的百分?jǐn)?shù),在需要了解待測部位的實際濃度時必須測定回收率。本文結(jié)果顯示,酮康唑凝膠劑經(jīng)皮給藥后,糖尿病大鼠腹部皮下的藥物質(zhì)量濃度均明顯高于正常大鼠組,其Cmax及AUC與正常組大鼠的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,說明糖尿病導(dǎo)致的皮膚