細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作-大學(xué)課件-

細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后．因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。【操作野消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)．紫外線照射消毒

30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置．否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒?！鞠词趾椭b】原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不

做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！净鹧嫦尽恳磺胁僮鳎绨囱b吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。但要注意：¨

金屬器械不能在為焰中燒的時(shí)間過長，以防退火，燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷?！?/p>

吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營養(yǎng)液中?！?/p>

開啟、關(guān)閉長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過高燒死細(xì)胞?！?/p>

膠塞過火焰時(shí)也不能時(shí)間長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。【操作】¨

動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快?！?/p>

不能用手觸及已消毒器皿的使用端?！?/p>

右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央?！?/p>

培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口?！?/p>

吸取營養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管?！?/p>

工作中不能面向操作野講話或咳嗽手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方?！?/p>

瓶口最易污染，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉。實(shí)驗(yàn)二常用儀器設(shè)備的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞培養(yǎng)中常用儀器設(shè)備的使用和保養(yǎng)方法二、器材¨

雙重純水蒸餾器¨

CO2培養(yǎng)箱¨

壓力蒸汽消毒器¨

凈化臺(tái)¨

倒置顯微鏡三、操作（1．一投）入C運(yùn)O2行培前養(yǎng)的箱準(zhǔn)備工作給培養(yǎng)箱和附件進(jìn)行消毒：用75％酒精浸泡

過的紗布擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁和附件進(jìn)行滅菌消毒，然后用無菌干紗布將酒精擦除干凈，這項(xiàng)工作

應(yīng)定期進(jìn)行。待箱內(nèi)酒精揮發(fā)干凈后，將箱內(nèi)溫度設(shè)定為37℃，CO2濃度設(shè)定至0％（設(shè)定方法見下面

的相關(guān)內(nèi)容），這種狀態(tài)維持8h以上。這步操作適用于首次啟動(dòng)運(yùn)行或長時(shí)間未用。用配套的供氣管將CO2儲(chǔ)氣瓶的減壓器與培養(yǎng)箱連接起來。注意檢查接點(diǎn)是否漏氣。（一）CO2培養(yǎng)箱氣瓶減壓器是用來調(diào)節(jié)CO2供氣量的裝置，它由雙表組成，左表是低壓表，右表是高壓表，高壓表連接螺桿。其使用方法如下：①打開CO2儲(chǔ)氣瓶前，先按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)減壓器調(diào)節(jié)螺桿，直到調(diào)節(jié)彈簧不受壓力為止。②把CO2儲(chǔ)氣瓶閥門緩慢打開，高壓表指示瓶內(nèi)氣體量讀數(shù)。③按順時(shí)針方向輕輕旋轉(zhuǎn)減壓器調(diào)節(jié)螺桿，使

CO2減壓，當(dāng)?shù)蛪罕碇羔樦傅?.03Mpa時(shí)，松動(dòng)低壓

表的出口，使CO2氣體緩慢流入培養(yǎng)箱。若壓力超過

0.03Mpa時(shí)，需再旋轉(zhuǎn)螺桿，放出一部分氣體后再調(diào)節(jié)。整個(gè)調(diào)節(jié)過程要細(xì)心、緩慢，若進(jìn)入培養(yǎng)箱的

CO2壓力過高，可沖破培養(yǎng)箱的CO2調(diào)節(jié)裝置或?qū)⒐?/p>

氣管彈開，導(dǎo)致CO2培養(yǎng)箱CO2調(diào)節(jié)量失控。（一）CO2培養(yǎng)箱2．設(shè)定培養(yǎng)箱溫度和CO2濃度通常CO2培養(yǎng)箱的使用條件為37℃，5％CO2。其設(shè)定程序見下表：所操作的鍵SET操作說明操作之后的指示1打開電源開關(guān)溫度指示器顯示當(dāng)前箱內(nèi)溫度2按SET鍵溫度指示器中數(shù)字閃爍按ENT存儲(chǔ)設(shè)定溫度；CO2指3按下 鍵和 鍵，按下該鍵，可使數(shù)字移位將數(shù)字設(shè)定到37.0下該鍵，可使數(shù)字增加4按下ENT鍵示器中數(shù)字閃爍。5按下 鍵和 將數(shù)同3字設(shè)定到05.0同3注意：在設(shè)定狀態(tài)中，當(dāng)不進(jìn)任何鍵操作持續(xù)90s之后，指示器將自動(dòng)恢復(fù)到當(dāng)前溫度和

CO2濃度顯示狀態(tài)。在設(shè)定狀態(tài)中，如不需要改變?cè)O(shè)定值，則按下SET便可跳到下一種設(shè)定狀態(tài)。當(dāng)旋轉(zhuǎn)上限報(bào)警溫度旋鈕時(shí)，即使不處于設(shè)定狀態(tài)，上限報(bào)警溫度都將改變。（二）雙重純水蒸餾器1、插上電源，打開冷凝水。2、打開水源，直到多余水從初次蒸餾的水位器溢水口流出。這時(shí)橫式燒瓶中水位達(dá)到一半高度，按A鍵指示燈亮，儀器進(jìn)入加熱狀態(tài)開始蒸餾。當(dāng)純水進(jìn)入二次蒸餾的橫式燒瓶一半水位高度后，按B鍵指示燈亮，儀器進(jìn)入二次蒸餾。若按B鍵指示燈不亮，只要把藍(lán)色塑料套管上下抽動(dòng)直到燈亮。以后隨著水位高低A、B按鍵能自動(dòng)開關(guān)。3、冷凝管過熱，溫度控制器觸點(diǎn)斷開會(huì)切斷電源。

待3－5分鐘冷凝管溫度降低，儀器會(huì)自動(dòng)接通電源。4、在操作過程中，調(diào)整簧管和磁性浮子的配合位置應(yīng)以水位降低時(shí)能自動(dòng)切斷電源為準(zhǔn)。（三）倒置顯微鏡接通電源。聚光鏡上的環(huán)形光欄推到通光孔處。使雙目鏡筒的鏡距與人的兩眼瞳距相一致。把標(biāo)本放到載物臺(tái)上，10X物鏡轉(zhuǎn)入光路，旋轉(zhuǎn)粗微動(dòng)手輪，使標(biāo)本成像，要使影像更清楚，還可以調(diào)整一下光線的強(qiáng)弱。在進(jìn)行相襯觀察時(shí)，把相襯片插入聚光鏡中，將孔徑光欄開至最大，把相襯物鏡（10X-）轉(zhuǎn)入光路，即可進(jìn)行相襯觀察。四、注意事項(xiàng)1、使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。培養(yǎng)瓶相互保持足夠的距離，間隔不足則有可能造成

箱內(nèi)溫度和二氧化碳濃度分布不均勻。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)清潔干凈。存放于箱內(nèi)的培養(yǎng)瓶先用酒精棉擦拭干凈；定期對(duì)培養(yǎng)箱內(nèi)壁及其附件進(jìn)行消毒；培養(yǎng)箱內(nèi)壁有冷凝水時(shí)，需用無菌紗布擦拭。③給增濕盤注入無菌蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。如果增濕盤水位降低，則應(yīng)將水補(bǔ)足。此外，每月對(duì)增濕盤進(jìn)行一次清洗。④取放培養(yǎng)物時(shí)要快速，減少二氧化碳的消耗。四、注意事項(xiàng)2、使用雙重純水蒸餾器應(yīng)注意的問題：3、使用倒置顯微鏡應(yīng)注意的問題：①擦拭鏡頭表面時(shí)，若去灰塵可用軟刷或紗布，若清除指紋和油跡，可用沾有二甲

苯的擦鏡紙或柔軟紗布擦拭。②勿隨便拆卸。③儀器應(yīng)放在干燥處。五、結(jié)果與討論每組制備至少500mL的三蒸水，記錄實(shí)際體積。繪制倒置顯微鏡所觀察到的影像圖。討論本次實(shí)驗(yàn)操作的難點(diǎn)和解決方法。實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗、包裝和消毒一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞培養(yǎng)常用實(shí)驗(yàn)器材的清洗要領(lǐng)、清洗步驟和注意事項(xiàng)。掌握細(xì)胞培養(yǎng)常用器材的包裝要領(lǐng)和要求。掌握除菌濾器的安裝、使用和拆除方法及操作注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理離體條件下，有害物質(zhì)直接同細(xì)胞接觸，細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，達(dá)到不含任何殘留物的要求。微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因，因此細(xì)胞培養(yǎng)用品在培養(yǎng)細(xì)胞前，要消毒或滅菌。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。三、器材培養(yǎng)皿（3）100mL培養(yǎng)瓶（4）25mL培養(yǎng)瓶（2）尖吸管（5）5mL或10mL移液管（3）青霉素小瓶（3）血球計(jì)數(shù)板（1）鹽水瓶（1）離心管（2）250mL燒杯（1）100mL燒杯（1）50或100mL玻璃注射器■1.玻璃器皿：三、器材2.金屬器械：解剖刀（1）大號(hào)圓頭鑷（1）眼科剪（3）眼科鑷（3）100目金屬篩網(wǎng)（1）正壓除菌濾器三、器材3.橡膠、塑料制品：青霉素瓶塞（4）小橡皮吸頭（6）大橡皮吸頭（4）鹽水瓶翻口塞（1）針頭濾器（5）培養(yǎng)瓶蓋（2小、4大）三、器材4.其它：5mL一次性注射器（5）金屬飯盒（1）紗布棉花

牛皮紙記號(hào)筆剪刀

棉繩

鋁箔四、試劑和材料¨

5％鹽酸¨

清潔液（酸液）¨

0.5mol/L

NaOH¨

0.5mol/L

HCl¨

三蒸水¨

75％酒精五、操作（一）玻璃器皿的清洗、包裝和消毒

1．玻璃器皿的清洗一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟。1）浸泡 新的或用過的玻璃器皿都要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，晾干或烘干（50℃）后用5％鹽酸浸泡過夜，然后用自來水反復(fù)振蕩沖洗后備刷洗；用過的玻璃器皿用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。刷洗將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干或烘干（50℃），備浸酸。浸酸浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時(shí)，一般過夜或更長。浸酸時(shí)放取器皿要小心。4）沖洗 刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”15次以上，最后用三蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干（50℃）后備包裝用。玻璃器皿的包裝包裝材料常用牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿、鋁箔等。小的培養(yǎng)器皿用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。玻璃器皿的消毒玻璃器皿的消毒可以用高溫濕熱滅菌（20－30min和高溫干熱消毒（160℃保持90－120分鐘）。（二）橡膠制品的清洗、包裝與消毒橡膠制品的清洗橡膠制品洗滌方法：浸泡后，2%NaOH煮沸15

分鐘，流水沖洗，1%HCl煮沸15分鐘(或浸泡

30分鐘)，流水沖洗，蒸餾水煮沸20分鐘，三蒸水浸洗2-3次，晾干或50℃烘干備用。橡膠制品的包裝細(xì)胞培養(yǎng)用的橡膠制品一般較小，用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)。橡膠制品的消毒高溫濕熱滅菌。（三）塑料制品的清洗、包裝與消毒塑料制品的清洗塑料制品質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。其清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和

50℃稀洗液刷洗，流水沖洗（15－20遍），晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸三次，三蒸水泡24小時(shí)，晾干或50℃烘干備用。塑料制品的包裝細(xì)胞培養(yǎng)用的塑料制品一般較小，用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)。塑料制品的消毒高溫濕熱滅菌。（四）金屬器械的清洗、包裝與消毒金屬器械的清洗放到含洗滌劑的水中，反復(fù)刷洗后，自來水反復(fù)沖洗干凈，晾干，用75％酒精擦拭，自來水反復(fù)沖洗干凈，最后三蒸水浸洗3次，晾干或50℃烘干備用。金屬器械的包裝較小的金屬器械用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)。

3．金屬器械的消毒金屬器械的消毒可以用高溫濕熱滅菌（20～30min）和高溫干熱消毒（160℃保持90－120分鐘）。（五）正壓除菌濾器的清洗、包裝與消毒正壓除菌濾器的清洗放到含稀洗滌劑的水中，反復(fù)刷洗后，流水沖洗15min漓水，蒸餾水浸泡24h，三蒸水浸泡24h，晾干或50℃烘干備用。正壓除菌濾器的包裝在包裝前應(yīng)將濾膜裝好（濾膜在使用前需經(jīng)三蒸水浸泡過夜，安裝時(shí)使用兩層0.22μm的濾膜，光面朝

上），然后用鋁箔或牛皮紙包好正壓除菌濾器的出液口和進(jìn)氣口，再用棉布將整個(gè)正壓除菌濾器團(tuán)團(tuán)裹住，并捆好。正壓除菌濾器的消毒121℃高壓濕熱滅菌20min。（六）針頭濾器的清洗、包裝與消毒針頭濾器的清洗、包裝與消毒同塑料制品，但是包裝前應(yīng)將濾膜裝好，安裝濾膜的

注意事項(xiàng)和要領(lǐng)同正壓過濾器。實(shí)驗(yàn)四動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制和無菌處理一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆张渲萍?xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液（RPMI-1640、DMEM等）的方法和操作要求。掌握抗菌素、消化液及Hanks液的配制方法。進(jìn)一步學(xué)習(xí)無菌操作，練習(xí)各實(shí)驗(yàn)器材的使用方法。練習(xí)細(xì)胞用液分裝方法。二、實(shí)驗(yàn)用品試管架、記號(hào)筆、圓頭鑷、廣口瓶

火柴、1000mL燒杯、不銹鋼正壓濾器針頭濾器、大、小濾膜、一次性注射器玻璃注射器三、操作（一）Hanks液的配制配方：甲液：NaHPO4·2H2O0.06克KH2PO40.06克MgSO4·7H2O0.20克葡萄糖1.00克NaCl8.00克三蒸水750毫升乙液：CaCl20.14克三蒸水100毫升配制程序：1、將乙液徐徐加入甲液中。2、將0.35克NaHCO3溶解在37℃100毫升三蒸水中。3、用數(shù)滴NaHCO3液溶解0.01克酚紅。4、將2、3液逐滴、攪拌加入到1液中。5、用三蒸水定容至1000毫升，充分混勻，4℃冰箱過夜。6、濾過消毒，小瓶分裝，冷藏。配制注意事項(xiàng)：¨

配制時(shí)各種藥品要依次溶解¨

含Ca2+和Mg2＋的物質(zhì)因容易出現(xiàn)沉淀，配制時(shí)要單獨(dú)溶解，然后在不斷攪拌下加入。（二）血清的滅活處理1、選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)。2、對(duì)照瓶內(nèi)放入與血清等體積的水。3、對(duì)照瓶內(nèi)插入準(zhǔn)確的溫度計(jì)，放入水浴鍋中，接通電源，調(diào)節(jié)溫度控制鈕，使溫度計(jì)溫度保持在56℃。4、血清瓶與帶溫度計(jì)的對(duì)照瓶一齊放入水浴鍋中，待溫度計(jì)所示溫度上升至56℃時(shí)，定時(shí)30min。5、大瓶血清滅活后，進(jìn)行分裝。6、分裝后，抽樣做無菌試驗(yàn)，－20℃～－70℃保存。（三）0.25％胰蛋白酶的配制1、稱取0.25克酶粉，用少量已消毒的D-Hanks液將胰蛋白酶粉調(diào)成糊狀。2、加適量已消毒的D-Hanks液，磁力攪拌3～5天即可溶解（室溫和4℃間斷進(jìn)行，室溫高于

30℃要減少酶液在室溫中的攪拌時(shí)間），溶解完全后定容至100mL。3、溶解后的酶液（深紅色）濾過除菌，分裝，－20℃凍存。（四）RPMI-1640的配制1、溶解培養(yǎng)基：將干粉培養(yǎng)基溶于總量1/3的三蒸水中，再用水洗包裝袋內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液

中。振蕩或超聲助溶，一般不要加熱助溶。2、補(bǔ)加試劑：根據(jù)包裝袋說明和試驗(yàn)需要加入

NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、

HEPES等其他試劑。3、加抗生素：一般抗生素終濃度為――青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml。市售青霉素為80萬U／瓶，可溶于4ml體積，每一升培養(yǎng)液中加

0.5ml即可。市售鏈霉素為100萬U／瓶，可溶于5ml體積，每一升培養(yǎng)液中也加0.5ml即可。（四）RPMI-1640的配制4、調(diào)pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情況下），然后用5％NaHCO3調(diào)節(jié)pH到7.2，加水定容到終體積(必要時(shí)用1

mol/L鹽酸和1

mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH)。5、過濾除菌：宜采用0.45um和0.22um濾膜各一張，上層為0.45um，下層為0.22um，以保證過濾效果。注意濾膜正面（光面）朝上。過濾后分裝于小瓶中（100或200ml）。6、加小牛血清：根據(jù)培養(yǎng)基配制的量將小牛血清分裝，冷凍保存（－20℃）。臨用前加入小牛血清(10%~20%)。四、注意事項(xiàng)1、新鮮三蒸水應(yīng)貯存與棕色磨口試劑瓶中，三蒸水存放時(shí)間不要超過兩周，最好現(xiàn)制現(xiàn)用。2、培養(yǎng)液配好后，應(yīng)先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃溫箱內(nèi)置24～48hr，以檢測培養(yǎng)液是否有污染。3、每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止?fàn)I養(yǎng)成分損失或者污染。實(shí)驗(yàn)安排¨

第一組：1）Hanks液的配制和分裝：分裝在

100mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶50mL，剩余的裝在鹽水瓶中。2）值日：領(lǐng)取DMEM培養(yǎng)基、

Hepes、青霉素、鏈霉素、5mL一次性注射器

10～15根；蒸三蒸水?！?/p>

第二組：1）Hanks液的配制和分裝：同上。2）10月19號(hào)（下星期三）完成CO2培養(yǎng)箱和無菌室的消毒工作；解凍分裝好的小牛血清；培養(yǎng)瓶的滅菌工作。實(shí)驗(yàn)安排¨

第三組：胰蛋白酶液的配制和分裝：分裝在

25mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶15mL，剩余的裝在小鹽水瓶中?！?/p>

第四組：1）小牛血清的滅活和分裝：分裝在

25mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶12.5mL，剩余的仍裝在小牛血清瓶中。2）準(zhǔn)備酒精棉。¨

第五組：培養(yǎng)液的配制和分裝：分裝在100mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶50mL，剩余的裝在鹽水瓶中?！?/p>

每組再清洗、包裝和滅菌4個(gè)培養(yǎng)瓶。注意：用完的器皿要及時(shí)浸泡和清洗實(shí)驗(yàn)五雞胚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諉螌蛹?xì)胞培養(yǎng)法（組織消化培養(yǎng)法）培養(yǎng)細(xì)胞的基本方法和操作過程。進(jìn)一步練習(xí)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌技術(shù)。初步掌握在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。二、實(shí)驗(yàn)原理所有組織中都有一定量的細(xì)胞間質(zhì)（纖維和基質(zhì)等），對(duì)細(xì)胞生長有妨礙作用（妨礙營養(yǎng)物質(zhì)的穿透），用胰酶消化能除去間質(zhì)，使組織松散成單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞易于生長。三、器材超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、酒精燈、吸管、培養(yǎng)瓶和蓋、

解剖剪、眼科剪、燒杯、鑷子（尖頭、圓頭

和彎頭）、離心管和蓋、離心機(jī)、血球記數(shù)

板、100目不銹鋼篩網(wǎng)、青霉素瓶和蓋、培養(yǎng)皿、水浴鍋實(shí)驗(yàn)結(jié)束后注意清洗用過的實(shí)驗(yàn)器材，為下周實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。下周實(shí)驗(yàn)所需器材清洗、包裝好后交給第四組同學(xué)在下周三時(shí)滅菌。四、試劑和材料¨

Hanks液¨

75％酒精（用于浸泡金屬器械）¨

0.25％胰蛋白酶¨

DMEM培養(yǎng)液(含小牛血清及青、鏈霉素)¨

雞胚：孵化10天的受精蛋五、操作1、取材取孵化10天的雞蛋，用75％酒精消毒彈殼，小心取出雞胚，放于無菌培養(yǎng)皿中，用解剖剪或解剖刀除去頭部，然后用彎頭眼科鑷夾起腹部皮膚，剪開腹腔和胸腔除去內(nèi)臟。2、漂洗和剪切將胚體放入另一培養(yǎng)皿中，用Hanks液清洗3次去除血污，切成幾小塊，然后轉(zhuǎn)移到無菌青霉素瓶中，在青霉素小瓶內(nèi)用眼科剪反復(fù)剪成

1mm3的小塊。3、消化加入適量0.25％胰蛋白酶溶液，一般每個(gè)雞胚加2mL消化液，蓋好橡皮塞，置37℃水浴中消化20～30min，消化時(shí)每隔5min搖動(dòng)一次，使組織塊散開。視組織塊變得疏松，顏色略變白時(shí)，從水浴中取出，在超凈工作臺(tái)中用吸管輕輕吸去消化液，加入2～3mL含小牛血清的培

養(yǎng)液，以終止消化。然后用吸管反復(fù)吹打，使大部分組織塊分散成單細(xì)胞狀態(tài)，靜置片刻，讓未被消化完的組織自然下沉，然后將上層液通過100目不銹鋼篩網(wǎng)，制備細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移入無菌離心管中備用。4、離心和計(jì)數(shù)離心（800r/min,10min），棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打混勻后取樣計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。5、接種培養(yǎng)每瓶培養(yǎng)瓶接種4mL細(xì)胞懸液，再添加6mL培養(yǎng)液，輕輕混勻后，蓋緊瓶塞，標(biāo)上細(xì)胞名稱，組號(hào)和接種日期等，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中開放培養(yǎng)（旋松培養(yǎng)瓶蓋）。6、觀察¨每天要對(duì)接種培養(yǎng)的細(xì)胞做常規(guī)性檢查，觀察的主要內(nèi)容是：污染與否、細(xì)胞生長狀態(tài)、PH（通過培養(yǎng)液顏色變化），如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁，表明已被污染，這時(shí)細(xì)胞不易貼壁生長，逐漸死亡。如培養(yǎng)液為桔紅色，一般說明細(xì)胞生長狀態(tài)良好?！г跊]有發(fā)生污染的情況下，一般按規(guī)24h，可見到許多細(xì)胞貼壁，由圓形懸浮狀態(tài)的細(xì)胞延展成短梭狀，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，逐漸呈現(xiàn)出具有長突起的梭形、星形或三角形的細(xì)胞形態(tài)。¨由于細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時(shí)換液一次。一般每2～3天換液1次。細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。一般用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。每個(gè)大方格的體積為0.1mm3計(jì)數(shù)板（25X16）的結(jié)構(gòu)及測定原理菌懸液濃度＝【25

*

（A/5）

*

B】/0.00001=50000A*BA—5個(gè)中方格中細(xì)胞總數(shù)B—菌懸液的稀釋倍數(shù)中格結(jié)構(gòu)圖計(jì)數(shù)方法1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計(jì)數(shù)板五個(gè)中格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/ml＝50000A*B，A—5個(gè)中方格中細(xì)胞總數(shù)；B—菌懸液的稀釋倍數(shù)注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。培養(yǎng)液換半量方法：¨

瓶口消毒?！?/p>

從瓶側(cè)面吸去原培養(yǎng)液量的一半?！?/p>

從瓶側(cè)面補(bǔ)加等體積新培養(yǎng)液?！?/p>

翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液覆蓋細(xì)胞面，瓶口消毒加塞。注意：培養(yǎng)液要事先預(yù)熱至37度。六、結(jié)果與討論日期培養(yǎng)液顏色變化細(xì)胞生長情況描述1．實(shí)驗(yàn)記錄表2．寫出本次實(shí)驗(yàn)個(gè)人操作體會(huì)。注意寫明實(shí)驗(yàn)中每一步是由誰參與操作的。實(shí)驗(yàn)六乳鼠肺細(xì)胞的原代培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1．學(xué)習(xí)和掌握組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞的基本方法和操作過程?！?/p>

2．進(jìn)一步掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌技術(shù)?！?/p>

3．掌握在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。二、實(shí)驗(yàn)原理組織切成0.5-1mm的小塊后，由于組織塊

體積很小，在不加任何粘著劑的情況下，它們也能直接貼附于瓶壁上，然后細(xì)胞

從組織塊邊緣向外長出生長暈，最后連

接成片而形成單層細(xì)胞。此方法程序簡

化，是常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法。三、器材¨

超凈工作臺(tái)¨

二氧化碳培養(yǎng)箱¨

普通顯微鏡¨

倒置顯微鏡¨

酒精燈¨

吸管¨

培養(yǎng)瓶¨

解剖剪¨

眼科剪¨

燒杯¨

鑷子（尖頭、圓頭和彎頭）四、試劑和材料¨

Hanks液¨

75％酒精¨

RPMI－1640培養(yǎng)液(含小牛血清及青、鏈霉素)¨

新生乳鼠（小鼠）五、操作（一）取材1、取新生乳鼠一只。2、采用頸椎脫臼法處死，然后把這個(gè)小鼠浸入盛有75%酒精的燒杯中2-3秒（默數(shù)

5下）。3、隨即攜入超凈工作臺(tái)內(nèi)，小鼠仰位放置到滅菌的培養(yǎng)皿中。4、用75％酒精消毒胸廓部位皮膚。5、打開消毒器械包，在胸廓正中線位處，用眼科彎鑷夾起乳鼠胸部皮膚（多夾些）,用解剖剪開適當(dāng)位點(diǎn)后,用兩把眼科彎鑷向左右兩側(cè)撕拉，皮膚外翻固定，充分暴露軀干部肌肉（注意：不要使表皮面接觸到已暴露出來的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，換一套金屬器械，沿著

隔膜剪斷胸廓，并將胸骨兩側(cè)肋骨剪斷。胸廓

暴露后，可見跳到的心臟和粉紅色的肺。換一

把彎頭眼科鑷，將彎頭向下，從心臟右上方插

入心肺連接處，輕輕向上用力，將心肺一齊取

出，放置在滅菌的培養(yǎng)皿中，用鑷子去除心臟，肺移入已加Hanks液的青霉素瓶內(nèi)。（二）漂洗用Hanks液清洗肺臟表面血污，然后用眼科直剪粗剪幾下，再用Hanks液漂洗多次，去凈血污，將洗凈的組織塊置青霉素小瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè)的多余液體。（三）剪切用眼科直剪將洗凈的組織塊反復(fù)剪成0.5-1立方毫米的小塊，此過程需20～30分鐘（剪切時(shí)為保持組織濕潤，可向組織塊滴加1～2滴培養(yǎng)液）。然后用吸管滴加幾滴培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻。（四）接種和培養(yǎng)用潤濕的吸管分次吸取小碎塊懸液，注意吸在吸管前端部，以免吸得過高，使組織小塊粘附于管壁而丟失。將組織碎塊在培養(yǎng)瓶底部均勻放置（塊距0.3cm大?。?，25毫升培養(yǎng)瓶放20～30塊為宜。然后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入適量培養(yǎng)液(液層厚約15mm)蓋好，標(biāo)記好，置37℃孵箱中培養(yǎng)4-24小時(shí)。待組織小塊略干燥，能牢固貼在瓶壁時(shí)，再慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液浸泡組織塊，靜置培養(yǎng)。操作過程中動(dòng)作一定要輕，減少振動(dòng)，否則會(huì)使組織塊脫落，影響貼壁培養(yǎng)。（五）觀察¨

靜置培養(yǎng)3天后開始在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。注意觀察培養(yǎng)組織小塊邊緣是否長出新細(xì)胞。一般最先出現(xiàn)的是形態(tài)不規(guī)則的游走細(xì)胞,接著是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞分裂，細(xì)胞數(shù)量增多時(shí)，在組織塊周圍可見到生長暈。隨后細(xì)胞生長分裂增快，呈放射狀向外擴(kuò)展逐漸連成一片。¨

注意檢查有否污染。¨

可根據(jù)培養(yǎng)液顏色，更換培養(yǎng)液?！?/p>

約10-15天后細(xì)胞可長成單層，即可傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)七 動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)傳代的基本方法和操作過程。二、實(shí)驗(yàn)原理¨

當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后（一般形成致密單層），則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中

擴(kuò)大培養(yǎng)，此過程為傳代培養(yǎng)。一般將

傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)作為傳代細(xì)胞的代

數(shù)。三、器材¨

超凈工作臺(tái)¨

二氧化碳培養(yǎng)箱¨

普通顯微鏡¨

倒置顯微鏡¨

酒精燈¨

吸管■培養(yǎng)瓶■燒杯■離心管■離心機(jī)■鑷子（圓頭）■血球記數(shù)板四、試劑和材料¨

Hanks液¨

75％酒精¨

0.25％胰蛋白酶¨

DMEM培養(yǎng)液(含小牛血清及青、鏈霉素)五、操作¨

1、吸去或傾出舊的細(xì)胞培養(yǎng)液(對(duì)于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法,對(duì)于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出)?！?/p>

2、吸取適量的Hanks液加入培養(yǎng)瓶中,輕輕振蕩后棄去，重復(fù)一次,以清除血清成分,利于胰酶消化?！?/p>

3、加入適量0.25%胰蛋白酶（一般0.1～0.2mL/cm2，以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個(gè)細(xì)胞層，37℃下消化2-3分鐘。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,肉眼觀察細(xì)胞單層，見細(xì)胞單層薄膜出現(xiàn)針孔大小空隙時(shí)即可吸除消化液(細(xì)胞的解離程度也可以通過倒置顯微鏡直接觀察判斷，一般以細(xì)胞突起縮回，細(xì)胞之間間隙增大，細(xì)胞縮成圓形等為準(zhǔn))。如消化程度不夠，可延長消化時(shí)間；如見大量細(xì)胞片狀脫落，表明已消化過頭，則不能吸除消化液而直接進(jìn)行下一步操作?！?/p>

4、加入適量培養(yǎng)液終止消化¨

5、吸取瓶中培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶皿底壁上的細(xì)胞層，至全部沖下，輕輕吹打，混勻，成細(xì)胞懸液，取樣計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104

/ml。15cm培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時(shí)，吸取1ml

細(xì)胞懸液加到新培養(yǎng)瓶中，加入4ml培養(yǎng)液，蓋好，置37℃孵箱中培養(yǎng)?！?/p>

6、觀察：細(xì)胞傳代后，應(yīng)每日對(duì)細(xì)胞進(jìn)行

觀察，注意是否污染及細(xì)胞貼壁和生長情況。六、注意事項(xiàng)¨

1、吹打過程需有序進(jìn)行，即從一邊開始到另一邊結(jié)束，注意邊角處?！?/p>

2、吹打時(shí)動(dòng)作不宜過猛。七、結(jié)果與討論¨

1．利用倒置顯微鏡，繪制出傳代細(xì)胞生長圖。¨

2．討論影響本次實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ闹饕蛩貙?shí)驗(yàn)八植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制方法和操作二、實(shí)驗(yàn)原理¨

配制植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基最方便的方法是預(yù)先配制不同組分(大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)、激素)的培養(yǎng)基母液，貯藏在冰箱，待配制培養(yǎng)基時(shí)取出，按比例稀釋?！?/p>

配制母液時(shí)為了減少工作量可以把幾種藥品配在同一母液中，但是應(yīng)該注意各種化合物的組合以及加入的前后順序，因?yàn)橐恍╇x子之間易發(fā)生沉4

4淀，如Ca2+和S0

2+，Ca2+、Mg2+和PO

3-

一起溶解后，會(huì)產(chǎn)生沉淀。一定要把每種試劑單獨(dú)、充分溶解后再按次序放入母液中。三、器材¨

高壓蒸汽滅菌鍋¨

250ml三角瓶（4個(gè)/組）¨

牛皮紙¨

pH試紙（5.4-7.0）¨

牛皮筋¨

電子天平¨

試劑瓶¨

線繩¨

PH計(jì)¨

燒杯（50、100、500、1000

m1）四、試劑和材料¨

1N

鹽酸¨

1N

NaOH¨

瓊脂¨

蔗糖¨

其它藥品見表MS培養(yǎng)基母液的配制¨

2,4-D五、操作1、MS培養(yǎng)基母液的配制：按照表（見講義）中數(shù)據(jù)分別配制大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)的母液，并在4℃冰箱中保存。鐵鹽的配制：在裝有800ml蒸餾水的燒杯中加入4粒

苛性鈉，溶解后加入7.46g

Na2EDTA·2H2O，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊慢慢加入5.56gFeSO4·7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至1000ml，置于冰箱中備用。2、植物激素母液的配制：1mg/ml的2,4-D溶液：取100mg的2,4-D，加入少量95%的酒精和1

N的NaOH溶解，再加蒸餾水定容至100ml。3、MS基本培養(yǎng)基的配制：分別吸取MS貯備液：50.0ml大量元素、5.0ml微量元素、5.0ml鐵鹽、5.0ml有機(jī)物質(zhì), 加入1L的搪瓷缸或燒杯中中，然后稱取蔗糖30.0g, 加入瓊脂8g，加蒸餾水約920ml，在電爐上加熱，煮沸，融化瓊脂，然后加水至950ml。（瓊脂也可熬化后再加入）。4、含2mg/L

2,4-D

MS培養(yǎng)基的配制：吸取2,4-D母