qRT-PCR相對(duì)定量計(jì)算詳解

qRT-PCR相對(duì)定量計(jì)算詳解做完轉(zhuǎn)錄組分析之后，一般都要求做qRT-PCR來(lái)驗(yàn)證二代測(cè)序得到的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)是否可靠。熒光定量PCR是一種相對(duì)表達(dá)定量的方法，他的計(jì)算方法有很多，常用的相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析方法有雙標(biāo)曲線法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用參照基因的ΔCt法和Pfaffl法。這里主要講解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何計(jì)算；qRT-PCR原理：以基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)收集熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以可以定量。Ct值是什么意思呢？Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cycle)。qRT-PCR在擴(kuò)增的時(shí)候都會(huì)有平臺(tái)期，在平臺(tái)期之前，PCR擴(kuò)增就是簡(jiǎn)單的指數(shù)增長(zhǎng)，也就是1變2，2變4，4變8…擴(kuò)增。數(shù)學(xué)形式就是2的ct次方，到了平臺(tái)期所有基因擴(kuò)增的數(shù)目是一致的，而唯一有區(qū)別的則是ct值的不同。所以不難推斷出ct值越小，反應(yīng)擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)數(shù)越少，目的基因起始含量越高。這里可以得到公式：計(jì)算-ΔΔCt在這里，我們有一個(gè)對(duì)照組，一個(gè)處理組，還有一個(gè)內(nèi)參基因和目的基因，想看一下目的基因在處理組中相對(duì)與對(duì)照中的表達(dá)差異，也就是計(jì)算-ΔΔCt：數(shù)據(jù)如下：1.計(jì)算每組內(nèi)參基因sgActionCt均值計(jì)算第一個(gè)Δct，即每組的待檢目的基因減去內(nèi)參基因的Ct值3.計(jì)算對(duì)照CK組中Δct的均值，再用處理組的每一個(gè)Δct減去剛剛計(jì)算的對(duì)照CK組的Δct均值，得到ΔΔct（紅框框）4.相對(duì)表達(dá)量計(jì)算，也就是相對(duì)于對(duì)照組:2^-ΔΔct：不難看出這里的-ΔΔct和我們轉(zhuǎn)錄組當(dāng)中的log2（foldc