何首烏中二苯乙烯苷分離純化工藝研究

何首烏中二苯乙烯苷分離純化工藝研究

0理化性質(zhì)及保健功能烏爾是蓼科植物的干燥部位。這是一種調(diào)理藥。其主要功能成分為2、3、5、4-4羥基二苯基-2-o-d-葡萄糖苷（以下簡(jiǎn)稱(chēng)二苯基丁基）。藥理分析表明,二苯乙烯苷具有顯著降低血脂、降低血漿膽固醇和防止脂肪肝、防止肝功能損害的作用[1~3],同時(shí)在改善記憶、保護(hù)大腦等方面還表現(xiàn)出獨(dú)特的生理保健功能[4~6]。近年來(lái),天然藥用植物中活性成分正成為國(guó)際醫(yī)藥食品界的研究熱點(diǎn),而且我國(guó)保健食品行業(yè)發(fā)展態(tài)勢(shì)迅猛,這為天然藥用植物的綜合開(kāi)發(fā)提供良好機(jī)遇和巨大市場(chǎng)。本研究旨在將聚酰胺柱層析技術(shù)應(yīng)用于何首烏中二苯乙烯苷的分離純化,為綜合開(kāi)發(fā)利用何首烏等天然藥用植物資源提供新方法和初步理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1聚酰胺的合成制何首烏提取液(二苯乙烯苷含量為0.115mg/mL),實(shí)驗(yàn)室制備;聚酰胺(30-60目),上海新量化工試劑有限公司提供;體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(分析純),宜興市展望化工試劑廠產(chǎn)品;體積分?jǐn)?shù)95%食用乙醇,合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。1.2膜玻璃層析柱756型紫外分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠產(chǎn)品;定制玻璃層析柱;電熱真空干燥箱,上海實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品;TGL—16型臺(tái)式高速離心機(jī),金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品。1.3方法1.3.1聚酰胺吸附劑的預(yù)處理稱(chēng)取適量聚酰胺干粉,置于燒杯中,加入適量食用乙醇溶液,以充分溶脹聚酰胺粉。1.3.2沉降均勻干將充分溶脹的聚酰胺吸附劑緩慢倒入玻璃層析柱,使其沉降均勻。待沉降到所需柱高時(shí),繼續(xù)用4~6倍柱床體積的食用乙醇淋洗,以平衡層析分離柱,直至洗出液加蒸餾水沒(méi)有渾濁為止。1.3.3洗脫溶劑的制備在每次試驗(yàn)中,量取20mL何首烏提取液自玻璃層析柱頂端開(kāi)口處小心緩慢加入,以不攪動(dòng)床層為準(zhǔn),靜置吸附一段時(shí)間,待樣品完全滲入吸附柱后,再打開(kāi)收集旋塞開(kāi)始收集。保持洗脫劑在適當(dāng)高度,以控制柱壓力;以一定量食用乙醇溶液進(jìn)行洗脫,每50mL分布收集洗脫液,檢測(cè)洗脫液中二苯乙烯苷的純度和洗脫率;合并收集所有的洗脫液,并濃縮成50mL的洗脫濃縮液。1.3.4測(cè)試指標(biāo)1.3.5上清液配制將提取液在離心機(jī)轉(zhuǎn)速為7200r/min下,離心10min,然后移取上清液并置于燒杯中,放入真空干燥箱中烘干,以適當(dāng)?shù)谋壤♂尣⒍ㄈ?。?05nm波長(zhǎng)下,檢測(cè)其吸光度,含量計(jì)算參照千梅等人的檢測(cè)方法。1.3.6不同體積分?jǐn)?shù)的食用乙醇洗脫量取何首烏提取液20mL,上玻璃層析柱,柱高40cm,靜置10min,然后分別以0%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%等不同體積分?jǐn)?shù)的食用乙醇進(jìn)行洗脫,洗脫流速為1.5mL/min,其余按1.3.5處理。1.3.7不同食用乙醇洗脫溶劑洗脫速率的測(cè)定量取何首烏提取液20mL,上玻璃層析柱,柱高40cm,分別靜置5,10,20,30,40,50,60min,然后分別以體積分?jǐn)?shù)70%食用乙醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫,洗脫流速為1.5mL/min,其余按1.3.5處理。1.3.8洗脫溶劑流速的確定量取何首烏提取液20mL,上玻璃層析柱,柱高40cm,靜置吸附30min,然后用體積分?jǐn)?shù)70%的食用乙醇為洗脫劑,分別以0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL/min流速進(jìn)行洗脫,其余按1.3.5處理。1.3.9洗脫溶劑用量及洗脫溫度量取何首烏提取液20mL,上玻璃層析柱,柱高分別為40,50,60,70cm,靜置吸附30min,然后用體積分?jǐn)?shù)70%的食用乙醇分別進(jìn)行洗脫,洗脫劑流速為1.0mL/min,其余按1.3.5處理。1.3.1純度和洗脫率對(duì)二苯乙烯苷分離的影響以二苯乙烯苷的純度、洗脫率為考核指標(biāo),選取食用乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫速度、洗脫柱高、吸附時(shí)間作為考察因素,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。同時(shí)采用加權(quán)綜合評(píng)分法來(lái)考察純度和洗脫率對(duì)二苯乙烯苷分離的綜合影響。綜合評(píng)分=洗脫率×0.4+純度×0.6.2結(jié)果與分析2.1加食用乙醇體積分?jǐn)?shù)食用乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二苯乙烯苷純度的影響見(jiàn)圖1。圖1表明,在食用乙醇體積分?jǐn)?shù)低于70%時(shí),二苯乙烯苷的純度與洗脫溶劑濃度呈正相關(guān)關(guān)系,此后,再增加食用乙醇體積分?jǐn)?shù),二苯乙烯苷的純度開(kāi)始下降。根據(jù)溶劑作用模式理論,隨著食用乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,其在聚酰胺吸附劑表面形成的雙吸附層趨勢(shì)增加,隨后二苯乙烯苷分子與吸附劑表面的食用乙醇分子發(fā)生締合作用,之后,食用乙醇帶著二苯乙烯苷分子擴(kuò)散到聚酰胺表面吸附中心,發(fā)生吸附、解吸連續(xù)循環(huán)過(guò)程,最終將二苯乙烯苷同其他成分分開(kāi)。當(dāng)食用乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),這種締合作用最佳;當(dāng)食用乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí),這種締合作用趨勢(shì)減弱,導(dǎo)致分離效果下降。2.2吸附時(shí)間對(duì)二苯乙烯苷純度的影響靜置吸附時(shí)間對(duì)二苯乙烯苷純度的影響見(jiàn)圖2。圖2表明,靜置吸附時(shí)間對(duì)二苯乙烯苷純度具有一定的影響,吸附時(shí)間從5min延長(zhǎng)到30min時(shí),二苯乙烯苷的純度從2.82%上升到3.75%;當(dāng)吸附時(shí)間再繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí),二苯乙烯苷的純度不再增加,反而呈下降趨勢(shì),而當(dāng)吸附時(shí)間為50min時(shí)的純度最低,為2.74%。這可能是因?yàn)槲綍r(shí)間過(guò)短,吸附不完全;而吸附時(shí)間過(guò)長(zhǎng),解吸困難等因素所致。為了盡量提高洗脫純度,縮短操作時(shí)間,選取30min為最佳靜置吸附時(shí)間。2.3食用乙醇流速對(duì)二苯乙烯苷純度的影響食用乙醇流速對(duì)二苯乙烯苷純度的影響見(jiàn)圖3。圖3表明,隨著食用乙醇流速的增加,二苯乙烯苷的純度逐漸下降。這可能是由于洗脫流速對(duì)食用乙醇與吸附在聚酰胺上的二苯乙烯苷間的交換速率進(jìn)行影響所致。當(dāng)食用乙醇流速為0.5mL/min時(shí),二苯乙烯苷的純度最高為4.10%;當(dāng)流速增至2.5mL/min,純度將為2.38%。這可能是因?yàn)榱魉龠^(guò)快,食用乙醇未能充分與二苯乙烯苷發(fā)生締合作用,導(dǎo)致對(duì)二苯乙烯苷分離純化的作用下降?？紤]到流速過(guò)低而大大延長(zhǎng)洗脫操作時(shí)間,因此選擇1.0mL/min為較佳的洗脫流速。2.4塔板分離效果洗脫柱高對(duì)二苯乙烯苷純度的影響見(jiàn)圖4。圖4表明,隨著洗脫柱高的增加,柱效越好,二苯乙烯苷的純度逐漸上升。根據(jù)色譜分離過(guò)程的塔板理論,柱的分離效果可用理論塔板數(shù)表示,若柱長(zhǎng)越長(zhǎng),則理論塔板數(shù)值越大,表示達(dá)成固液平衡的次數(shù)越多,分離發(fā)生的機(jī)會(huì)也越多,柱效越好。圖4還顯示,當(dāng)柱高增為60cm時(shí),純度上升幅度明顯減緩,鑒于實(shí)驗(yàn)室分離用層析柱總長(zhǎng)度為80cm,同時(shí)考慮到伴隨柱高的增加,洗脫時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng),綜合考慮,選用60cm柱高為較佳分離柱高。2.5樣品的洗脫工藝條件優(yōu)化柱層析分離正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,正交試驗(yàn)的方差分析見(jiàn)表2。表1極差分析表明,對(duì)二苯乙烯苷分離效果影響的各因素主次順序?yàn)?食用乙醇體積分?jǐn)?shù)>食用乙醇流速>洗脫柱高>吸附時(shí)間。表2方差分析表明,食用乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著地影響二苯乙烯苷分離的效果,食用乙醇洗脫速度和洗脫柱高為較顯著因素,而在本試驗(yàn)研究的范圍內(nèi),靜置吸附時(shí)間對(duì)二苯乙烯苷的分離影響不顯著。表1的K值分析表明,二苯乙烯苷分離的優(yōu)選工藝條件為A3B2C3D1,但從直觀分析可知,二苯乙烯苷分離的優(yōu)選提取工藝條件為A2B2C3D1。為了確定較佳的分離工藝條件,本研究通過(guò)驗(yàn)證性試驗(yàn)從這兩種工藝條件中優(yōu)選一個(gè)較好的分離條件。分離工藝條件A3B2C3D1和A2B2C3D1的結(jié)果比較見(jiàn)表3。從表3中可以看出,A2B2C3D1的洗脫率和純度高于A3B2C3D1的?？紤]到食用乙醇體積分?jǐn)?shù)是顯著因素,同時(shí)為提高生產(chǎn)效率和節(jié)約能源,最終確定較佳的分離工藝條件為A2B2C3D1,即體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液,以1.0mL/min的流速進(jìn)行洗脫,洗脫柱高為70cm,靜置吸附時(shí)間為20min。3模型結(jié)果分析(1)二苯乙烯苷的較佳分離工藝條件為:食用乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%,食用乙醇洗脫流速為1.0mL/min,洗脫柱高為70cm,靜置吸附時(shí)間為20min。(2)對(duì)分離效果影響的各因素主次順序依次為:食用乙醇體積分?jǐn)?shù)>食用乙醇流速>洗脫柱高>靜置吸附時(shí)間。通過(guò)方差分析檢驗(yàn)可知,食用乙醇體積分?jǐn)?shù)