中藥復(fù)方中藥對(duì)小鼠急性毒性研究

中藥復(fù)方中藥對(duì)小鼠急性毒性研究

朱沙是由否定的砂礦組成的礦石，也被稱為丹砂和郴州砂。入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》至今已有2000多年歷史。其具有清心鎮(zhèn)驚,安神解毒的功效。朱砂主要成分為HgS,另外還含有少量的游離汞和可溶性汞鹽。輕粉(Hg2Cl2),又名甘汞,也是一種含汞的礦物藥。由于朱砂和輕粉都含汞等重金屬離子,自古以來(lái)就被認(rèn)為是一種有毒之品,在國(guó)外甚至限制其使用,質(zhì)疑甚至反對(duì)朱砂和輕粉入藥者頗有人在,大大影響了其在臨床上的應(yīng)用。朱砂安神丸是臨床上常用的安神中成藥,但其汞含量超歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)10萬(wàn)倍,究竟朱砂安神丸毒性大小及朱砂毒性能否與其他含汞化合物如氯化汞(HgCl2)等同?本文通過(guò)對(duì)HgCl2、輕粉、朱砂及朱砂安神丸的急性毒性對(duì)比研究,來(lái)探討朱砂及其復(fù)方(朱砂安神丸)的毒性。1材料表面1.1動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠,體重20~22g,雌雄各半,由重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)提供,許可證號(hào)SCXK(渝)2007001。1.2pcr、氯化汞朱砂,購(gòu)自貴州省萬(wàn)山特區(qū)礦產(chǎn)公司;朱砂安神丸,購(gòu)自哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠(批號(hào)0806708);氯化汞,輕粉,均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;PowerSYBRRGreenPCRMasterMix,購(gòu)自美國(guó)ABI公司;RNA純化試劑盒,購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司。1.3實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)F732-V型冷原子吸收測(cè)汞儀,上海華光儀器儀表廠;原子熒光光譜儀,北京科創(chuàng)海光儀器有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀,美國(guó)BIO-RAD公司;TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Eppendorf5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;多功能梯度PCR儀,德國(guó)Eppendorf公司。2方法2.1砂操作劑量lg將42只小鼠稱重后隨機(jī)分為7組,每組6只,雌雄各半:空白對(duì)照組,給予正常飲食;朱砂安神丸低劑量組,10g·kg-1(Hg0.9g·kg-1),ig。朱砂安神丸高劑量組,20g·kg-1(Hg1.8g·kg-1),ig。朱砂低劑量組,0.3g·kg-1(Hg0.26g·kg-1,ig。朱砂高劑量組,16g·kg-1(Hg13.3g·kg-1),ig,HgCl2組,70mg·kg-1(Hg0.05g·kg-1),ig,輕粉組,61.2mg·kg-1(Hg0.05g·kg-1),ig,各組小鼠均早晨給藥1次。8h后斷頭處死,取血、肝臟和腎臟。2.2肝腎功能測(cè)試血液離心取血清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素(UREA)和肌酐(CREA)。2.3病理檢測(cè)取小鼠肝臟的同一部位、同側(cè)腎臟,10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察其組織病理變化。2.4pcr擴(kuò)增條件及數(shù)據(jù)表達(dá)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取并純化RNA,并分別在260nm和280nm處測(cè)其吸光度,計(jì)算出A260/A280值。然后應(yīng)用PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件:25℃,10min;48℃,60min;95℃,5min;4℃后適當(dāng)時(shí)候取出。反應(yīng)結(jié)束后,加DEPC水,1∶1稀釋。PCR擴(kuò)增:PCR總反應(yīng)體系為15μL,其中包括:cDNA3μL,SYBRRGREENPCRMasterMix7.5μL,DEPC水4μL,混合引物0.5μL,然后應(yīng)用iCycleriQreal-timePCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:95℃,10min;95℃,15s;60℃,60s。40個(gè)循環(huán)。引物由寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成,MT-1同義鏈:5′-AATGTGCCCAGGGCTGTGT-3′反義鏈:5′-GCTGGGTTGGTCCGATACTATT-3′;MT-2同義鏈:5′-TGTGCCTCCGATGGATCCT-3′反義鏈:5′-GCAGCCCTGGGAGCACTT-3′;以18S為內(nèi)標(biāo),同義鏈:5′-CGAACGTCTGCCCTATCAACTT-3′反義鏈:5′-CCGGAATCGAACCCTGATT-3′。數(shù)據(jù)處理:以Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)計(jì)算下列數(shù)據(jù):平均Ct值=(Ct1+Ct2)/2;dCt=均數(shù)-中間值;基因的表達(dá)以2^(-dCt)表示;以MT-1,MT-2基因的表達(dá)/18s基因的表達(dá)對(duì)每個(gè)MT-1,MT-2mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)方法測(cè)定肝腎組織中汞的蓄積量,稱取適量組織于消化罐中,加入5mL濃硝酸,170℃烘箱中消化3h,取出后用去離子水定容至25mL。測(cè)汞儀預(yù)熱0.5h后,吸取溶液5mL于汞氣發(fā)生瓶中,用去離子水補(bǔ)足至15mL,加入200g·L-1的氯化亞錫1mL,立即通氣進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:方法同上,分別吸取40μg·L-1的汞標(biāo)準(zhǔn)液0,1,2,3,4,5,10mL于汞氣發(fā)生瓶中,加入氯化亞錫后立即進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0004X+0.0026,r=0.999。2.6統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。P<0.05表明有顯著差異。3結(jié)果3.1空白對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果比較小鼠一次給藥后,藥物對(duì)其肝功能并無(wú)影響,各組小鼠血ALT和AST檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HgCl2組小鼠血UREA的水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05),表明HgCl2對(duì)小鼠腎臟功能造成了損傷(表1)。3.2砂不同劑量對(duì)小鼠汞蓄積量的影響與空白對(duì)照組相比,HgCl2組小鼠肝腎組織中汞蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他各組(P<0.05),朱砂高劑量組、輕粉組小鼠汞蓄積量也明顯增高(P<0.05),而朱砂安神丸組、朱砂低劑量組之間無(wú)明顯差異(表2)。3.3砂靜脈內(nèi)砂對(duì)mt-2基因表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比,HgCl2組小鼠肝腎組織中MT-1和MT-2基因表達(dá)明顯高于其他各組,朱砂高劑量組MT-1和MT-2基因表達(dá)亦高于其他各組,而朱砂安神丸組、朱砂低劑量組和輕粉組MT-1和MT-2基因表達(dá)無(wú)明顯差異(表3)。3.4小鼠肝腎組織病理學(xué)反應(yīng)朱砂高劑量組及HgCl2組小鼠腎臟組織腎小球變性,腎小管出現(xiàn)炎癥反應(yīng),細(xì)胞腫脹,出現(xiàn)空泡(圖1)。朱砂高劑量組及HgCl2組小鼠肝小葉內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞腫脹,變性,出現(xiàn)點(diǎn)狀嗜酸性變(圖2)。4對(duì)hgs和hgcl2基因表達(dá)的影響本試驗(yàn)中,單次給藥后,朱砂安神丸組(約是臨床劑量的5,10倍)小鼠肝腎組織中汞蓄積量很少,對(duì)肝腎功能和MT-1和MT-2mRNA的表達(dá)也無(wú)太大影響,病理結(jié)果檢查也未發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝腎組織有明顯損傷。作者以往的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),小鼠給予20g·kg-1的朱砂安神丸20d后,藥物在肝腎組織中蓄積量很少,對(duì)MT-2mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。這都說(shuō)明,當(dāng)小鼠給予大劑量的朱砂安神丸(約是臨床劑量的10倍)后,在肝腎組織內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)明顯的汞蓄積,也不會(huì)對(duì)肝腎造成明顯的病理?yè)p傷。通過(guò)本試驗(yàn)的研究結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn),一次性大量口服給藥后,低劑量的朱砂組(約是臨床劑量的5倍)小鼠肝腎組織中汞蓄積量和空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異,病理切片也未發(fā)現(xiàn)明顯組織損傷,但是高劑量朱砂組(約是臨床劑量的200倍)小鼠卻出現(xiàn)了明顯的毒性反應(yīng),表現(xiàn)為肝腎組織中汞蓄積量增高,MT-1和MT-2mRNA的表達(dá)增加,并且出現(xiàn)了病理?yè)p傷。相對(duì)于高劑量的朱砂,HgCl2對(duì)小鼠的毒性作用更大,表現(xiàn)為肝腎組織中汞蓄積量更高,對(duì)MT-1和MT-2基因的誘導(dǎo)作用更強(qiáng),并且對(duì)腎臟功能產(chǎn)生了影響。這就說(shuō)明,雖然高劑量的朱砂對(duì)小鼠產(chǎn)生了毒性作用,但是其毒性仍低于HgCl2,也提示了在臨床上,朱砂用量在規(guī)定的劑量范圍內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用。朱砂的主要成分為HgS,《中國(guó)藥典》規(guī)定朱砂中HgS含量不得低于96%,而HgS為一種共價(jià)化合物,極難溶于水,其溶解度僅為1.4×10-24g·L-1,由于HgS的難溶性,從而必然導(dǎo)致其進(jìn)入人體后,難以被機(jī)體吸收利用,導(dǎo)致生物利用率低,據(jù)報(bào)道,HgCl2的口服吸收率為7%~15%,朱砂的口服吸收率僅為0.2%,而有機(jī)汞可高達(dá)100%。HgCl2進(jìn)入體內(nèi)后,主要蓄積于腎小管上皮細(xì)胞,從而導(dǎo)致腎臟的損傷。在本試驗(yàn)中,朱砂和朱砂安神丸在機(jī)體中汞蓄積量很低,但給予HgCl2后卻有大量的汞蓄積于肝腎,并對(duì)肝腎造成損傷,從而說(shuō)明,HgS和HgCl2的性質(zhì)不同,在體內(nèi)的吸收代謝途徑的不同,因此導(dǎo)致了朱砂及其復(fù)方的毒性明顯低于HgCl2。金屬硫蛋白(MT)是一種富含巰基的金屬結(jié)合蛋白,廣泛存在于肝、心、腎等器官和組織細(xì)胞的胞質(zhì)中,其可以和多種有毒金屬結(jié)合,從而解除重金屬對(duì)人體的毒性,對(duì)保護(hù)肝、腎等重要器官具有極其重要的意義。MT的誘導(dǎo)是體內(nèi)汞毒性的敏感標(biāo)志。在本試驗(yàn)中,HgCl2組小鼠肝腎組織中MT-1和MT-2mRNA表達(dá)顯著增高,朱砂高劑量組也有所增高,但要明顯低于HgCl2組,其他組與空白對(duì)照組相比無(wú)差異。由于HgS在體內(nèi)汞蓄積量少,從而導(dǎo)致朱砂與其復(fù)方中的汞對(duì)機(jī)體的影響較小,沒(méi)有影響MT-1和MT-2基因的表達(dá),而HgCl2在體內(nèi)的汞蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組,故顯著的誘導(dǎo)了MT-1和MT-2基因的表達(dá),這也從一個(gè)側(cè)面反映出HgCl2的毒性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于朱砂及其復(fù)方。輕粉(Hg2Cl2),又名甘汞,也是中醫(yī)常用的一種礦物藥,外用有殺菌作用,內(nèi)服可通利大便,其毒性亦不能與HgCl2相比。在本試驗(yàn)中,輕粉組小鼠肝腎組織中汞蓄積量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HgCl2組,其對(duì)MT-1和MT-2基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用也弱于HgCl2,另外,對(duì)肝腎組織也無(wú)明顯的病理?yè)p傷。輕粉雖與HgCl2的含汞量相同(Hg0.05g·kg-1),但由于它們的存在形式不同,從而導(dǎo)致其毒性要明顯低于HgCl2。有學(xué)者研究報(bào)道,朱砂急性毒性很低,小鼠單次灌胃朱砂,即使劑量較大,也不會(huì)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng),梁愛(ài)華等報(bào)道一次性灌胃給予朱砂的最大耐受量達(dá)到24g·kg-1時(shí),小鼠未出現(xiàn)死亡,也未出現(xiàn)呼吸抑制,抽搐等反應(yīng),解剖未見(jiàn)臟器異常病變。而在本試驗(yàn)中,當(dāng)小鼠一次性給予16g·kg-1的朱砂時(shí),就已經(jīng)出現(xiàn)了汞蓄積量的增高和基因表達(dá)的改變,以及組織的損傷,這就說(shuō)明,小鼠一次灌胃較大劑量的朱砂時(shí),雖未出現(xiàn)死亡等明顯的毒性反應(yīng),但是在機(jī)體內(nèi)就已經(jīng)出現(xiàn)了汞的蓄積和基因表達(dá)的改變。所以,雖然朱砂急性毒性很低,但是如果單次給藥量過(guò)大,同樣可以造成機(jī)體的損傷。丁國(guó)華等在研究大鼠口服朱砂的組織分布時(shí),發(fā)現(xiàn)大鼠連續(xù)口服朱砂后,心臟、肝臟、腎臟及大腦中均有汞的蓄積,但是以腎臟中汞的蓄積量最高,梁愛(ài)華等在研究中發(fā)現(xiàn),腎臟中汞的蓄積量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肝臟。文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為含汞中藥及其制劑對(duì)腎臟的損害最大,在本試驗(yàn)中,小鼠一次性灌胃朱砂后,腎臟中汞的蓄積量要高于肝臟,對(duì)腎臟的毒性也大于肝臟,這和以往的研究結(jié)果相符。近年來(lái),有學(xué)者提出以總汞含量作為處方中朱砂的測(cè)定指標(biāo),并以HgCl2的毒性代表朱砂的毒性。在本試驗(yàn)中,H