針刺對下丘腦室旁核胃相關(guān)神經(jīng)元作用的影響

針刺對下丘腦室旁核胃相關(guān)神經(jīng)元作用的影響

穴位選取的原則1.使用細(xì)胞外記錄技術(shù)在大鼠胃擴張的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)特定的室側(cè)核胃函數(shù)，并觀察不同針刺方法對下肢室側(cè)核胃函數(shù)的影響。2文中選“足三里”、“內(nèi)關(guān)”、“脾俞”、“胃俞”4個穴位是近年針灸治療胃腸道疾病中應(yīng)用頻率最高且有效的主穴,選穴具有科學(xué)性。3實驗重點觀察了高位中樞如室旁核在針刺治療胃腸道疾病中所發(fā)揮的作用,為經(jīng)脈-臟腑相關(guān)理論及臨床指導(dǎo)提供依據(jù)。0室旁核與內(nèi)臟功能系統(tǒng)下丘腦利用其整合功能對自主神經(jīng)進(jìn)行調(diào)節(jié),通過將不同內(nèi)臟功能及軀體運動、內(nèi)分泌、情緒等整合以達(dá)到維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的目的。下丘腦室旁核位于下丘腦的上端,第三腦室的兩側(cè),其作為下丘腦前區(qū)最重要的核團(tuán)之一,在對內(nèi)臟活動的整合和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控中發(fā)揮了不可替代的作用。同時,室旁核(hypothalamicparaventricularnucleus,PVN)接受來自上行的內(nèi)臟和軀體感覺系統(tǒng)的傳入,憑借著其與腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)、孤束核、迷走神經(jīng)背核之間廣泛的纖維投射,參與了對內(nèi)臟功能活動的調(diào)控。課題組前期的研究顯示,來自心胃等內(nèi)臟的初級傳入信息和體表的針刺感覺信息,在孤束核(nucleusofthesolitarytract,NTS)進(jìn)行信息的匯聚及整合后,可能向高位中樞傳遞。有研究表明孤束核與室旁核之間存在著雙向纖維投射,既往關(guān)于針刺對胃功能的調(diào)節(jié)作用機制多以外周為主,涉及中樞尤其是高位中樞的研究較少,因此本研究旨在通過觀察胃的內(nèi)臟感覺傳入和針刺穴位的軀體感覺傳入在室旁核的整合作用,探討室旁核對針刺調(diào)節(jié)胃運動作用機制的影響,為進(jìn)一步發(fā)展經(jīng)(脈)穴-臟腑相關(guān)理論提供更為豐富的理論依據(jù)。1胃擴張刺激試驗設(shè)計:動物實驗觀察。時間及地點:實驗于2013年3至9月在廣東省肇慶市康達(dá)動物實驗中心實驗室完成。材料:實驗方法:體表刺激點定位:按照中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會1992年制訂的《實驗動物穴位定位標(biāo)準(zhǔn)》及擬人對照法。內(nèi)關(guān):前肢下1/6折點處內(nèi)側(cè),橈、尺骨縫中;足三里:腓骨小頭下約5mm;脾俞:第11、第12胸椎棘突間旁開5mm處;胃俞:第12胸椎棘突下旁開5mm。胃擴張造模:大鼠于實驗前禁食不禁水24h,予以20%烏拉坦(6mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,上腹部剔除毛發(fā),于劍突下沿腹白線縱向剪開皮膚、肌層和腹膜,充分暴露胃體,用小剪刀在距離幽門0.5cm處的十二指腸處避開血管,剪一個“一”字形小口,將連接在聚乙烯軟管上的氣囊推進(jìn)胃內(nèi),推至胃竇部后,將切口荷包縫合,接注射器針頭的聚乙烯軟管經(jīng)三通管與壓力換能器及充滿蒸餾水的注射器連接,完全排空氣囊、軟管等處的氣泡后,校對換能器,向氣囊內(nèi)注水5-8mL,記錄胃內(nèi)壓≥5.32kPa(40mmHg)時所需的注水量。針刺時,每擴張90s需抽回氣囊內(nèi)的水,停止胃擴張刺激60s,以維持胃擴張的壓力,防止長時間的擴張損傷胃。室旁核放電記錄:大鼠行胃擴張造模后,將其固定于腦立體定位儀上,參照Paxions-Watsona大鼠腦立體定位圖譜對室旁核進(jìn)行精準(zhǔn)定位(AP:1.5mm,L:0.4mm,H:6.8-8.2mm)并鉆孔。于顯微鏡下緩慢地將電極插推至腦表面,予石蠟油覆于腦表面以防止干燥及減少腦波動對電極位置的影響。在微電極推進(jìn)器的操作下,以1μm/s的速度將金屬電極推進(jìn)至室旁核,遇到放電即刻停止,待放電基線平穩(wěn)后,予以胃擴張刺激30s,同時記錄胃內(nèi)壓;放電平穩(wěn)后再分別針刺“足三里”、“內(nèi)關(guān)”、“脾俞”、“胃俞”等穴位各30s。電極部位的確定:灌流取材:每只大鼠記錄完畢后,室旁核予以電損毀,損毀參數(shù)為連續(xù)單電流,強度為1mA,頻率50Hz,波寬0.5ms,持續(xù)1min。開胸,經(jīng)左心室插管至升主動脈,先用150mL生理鹽水沖去血液,再以體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液灌注固定,持續(xù)時間40-45min。取下丘腦,于上述新鮮固定液中固定。1周后行冰凍冠狀連續(xù)切片,切片厚度為30μm,貼于載玻片上,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行標(biāo)記位點鑒定。取記錄位點及損毀位點(如圖1所示,紅色三角形區(qū)域為核團(tuán)的位點,為室旁核)正確的單位進(jìn)行統(tǒng)計分析,位置不符合者資料棄之不用。主要觀察指標(biāo):神經(jīng)元放電數(shù)。資料分析:采用Spike2神經(jīng)信號分析軟件(UK)進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理。神經(jīng)元對刺激的反應(yīng)主要有興奮、抑制和無反應(yīng)有3種情形,以刺激前后神經(jīng)元放電頻率變化超過30%作為標(biāo)準(zhǔn)。刺激前后頻率變化增加30%為興奮性神經(jīng)元,刺激前后頻率變化減少30%為抑制性神經(jīng)元,刺激前后頻率變化在30%內(nèi)為無反應(yīng)神經(jīng)元。實驗結(jié)束后進(jìn)行組織學(xué)鑒別,電極記錄部位不正確者,數(shù)據(jù)棄之不用。2室旁核胃擴張神經(jīng)元對針刺的反應(yīng)率2.156個室旁核胃擴張相關(guān)神經(jīng)元對針刺腧穴的反應(yīng)60只大鼠共記錄到109個室旁核神經(jīng)元放電。109個室旁核神經(jīng)元中與胃擴張相關(guān)的神經(jīng)元有56個,56個胃擴張相關(guān)神經(jīng)元對體表刺激反應(yīng)的反應(yīng)結(jié)果如表1所示。2.2室旁核胃擴張神經(jīng)元對針刺有反應(yīng)神經(jīng)元的出現(xiàn)率60只大鼠的4個穴位有反應(yīng)神經(jīng)元的出現(xiàn)頻率各有差異,其反應(yīng)均以興奮性為主,其出現(xiàn)率如表2所示。在109個自發(fā)放電的神經(jīng)元中,56個胃擴張相關(guān)神經(jīng)元中興奮性神經(jīng)元占40個,而抑制性神經(jīng)元僅占16個,且40個胃擴張興奮性神經(jīng)元中對來自體表的刺激也以興奮性神經(jīng)元為主。56個胃擴張相關(guān)神經(jīng)元中,對針刺足三里(圖2A)、內(nèi)關(guān)(圖2B)、脾俞(圖2C)、胃俞(圖2D)有反應(yīng)的神經(jīng)元個數(shù)分別是43,47,28,35,有反應(yīng)的神經(jīng)元出現(xiàn)的比例分別是76.79%,83.47%,50.00%,62.50%。3穴位與內(nèi)臟功能經(jīng)脈-臟腑相關(guān)理論是近年來針灸臨床和機制研究的核心問題,經(jīng)脈和臟腑間的復(fù)雜聯(lián)系成為中醫(yī)理論體系中的亮點。《靈樞·海論》篇強調(diào):“夫十二經(jīng)脈者,內(nèi)屬于府臟,外絡(luò)于支節(jié)。”肢,是指四肢,節(jié),是指骨節(jié),亦指穴位,說明經(jīng)脈在其循行過程中分別歸屬于相應(yīng)的臟或腑,同時與相表里的臟腑發(fā)生屬絡(luò)關(guān)系。亦提示十二經(jīng)脈的重要功能是溝通臟腑與體表肢節(jié)之間的聯(lián)系,有學(xué)者稱之為“是世界上最早提出軀體內(nèi)臟相關(guān)的學(xué)說”?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》云“五臟之道皆出于經(jīng)隧,以行其血氣,血氣不和,百病乃變化而成”,意在說明氣血通過經(jīng)絡(luò)的運行來達(dá)到濡養(yǎng)內(nèi)臟的功能,不能濡養(yǎng)內(nèi)臟,則百病皆生,切實說明了氣血通過經(jīng)絡(luò)對五臟的濡養(yǎng)之功?！鹅`樞·經(jīng)脈篇》和《素問·骨空論》有這樣的闡述,足陽明胃經(jīng)(起于鼻……從大迎前下人迎,循喉嚨,入缺盆,下膈,屬胃……),其循行聯(lián)系的臟腑和五官有胃、脾、心、小腸及鼻等。手太陰心經(jīng)(……其支者,復(fù)從心系卻上肺……),其聯(lián)系的臟腑及五官包括心、小腸、肺及咽等。足太陰脾經(jīng))……上膝股內(nèi)前廉,入腹,屬脾,絡(luò)胃……),其聯(lián)系的臟腑及五官有脾、胃、心及舌等。由此可見,一臟可與多條經(jīng)脈聯(lián)系,相應(yīng)的臟腑除了與互為表里的經(jīng)脈聯(lián)系外,還和其他的經(jīng)脈有直接或間接的關(guān)聯(lián),這就構(gòu)成了廣泛的經(jīng)脈-臟腑相關(guān)系統(tǒng)?！端貑枴そ?jīng)脈別論》曰:“食氣入胃,濁氣歸心,淫精于脈,脈氣流經(jīng),經(jīng)氣歸于肺,肺朝百脈,輸精于皮毛,毛脈合精,行氣于府,府精神明,流于四臟,氣歸于權(quán)衡,權(quán)衡以平,氣口成寸,以決死生?！闭f明水谷精微在濡養(yǎng)經(jīng)脈的同時亦通過經(jīng)脈之氣,輸注于臟腑,這也間接地闡述了經(jīng)脈與臟腑之間的聯(lián)系。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“有諸內(nèi),必形諸外”,即人體是一個內(nèi)外緊密聯(lián)系的整體,內(nèi)臟有病,可反應(yīng)于相應(yīng)的形體官竅。而人為地刺激體表某些相應(yīng)的穴位,也能引起相關(guān)內(nèi)臟功能的改變,進(jìn)而起到治療作用。經(jīng)絡(luò)是經(jīng)脈和絡(luò)脈的總稱,有著運行氣血、溝通人體上下和聯(lián)絡(luò)臟腑肢節(jié)的功用,有學(xué)者認(rèn)為揭示體表與體表、體表與內(nèi)臟之間的特定聯(lián)系是經(jīng)絡(luò)學(xué)說的精華所在?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》:“五臟之道皆出于經(jīng)隧,以行其血氣,血氣不和,百病乃變化而成”高度概括了經(jīng)脈和五臟之間的聯(lián)系?！鹅`樞·海論》:“夫十二經(jīng)脈者,內(nèi)屬于府藏(腑臟),外絡(luò)于支節(jié)”則強調(diào)了十二經(jīng)脈在溝通臟腑和體表聯(lián)系中發(fā)揮的重要作用。解剖學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)研究認(rèn)為,針刺信息主要通過刺激感受器外周神經(jīng)系統(tǒng),將神經(jīng)沖動上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng),通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行信息整合來調(diào)控神經(jīng)、內(nèi)分泌、體液網(wǎng)絡(luò),繼而影響靶器官。以往的研究表明,這種經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象是脊髓水平神經(jīng)活動的一種功能表現(xiàn),它按相對特異的傳入-傳出-傳入反射活動的模式來監(jiān)視機體的功能狀態(tài)。從神經(jīng)解剖學(xué)的軀體傳入來看,內(nèi)關(guān)和足三里分別是手厥陰心包經(jīng)和足陽明胃經(jīng)的穴位,兩者均與胃有密切關(guān)系,且兩者分別處于不同的神經(jīng)節(jié)段。根據(jù)神經(jīng)生物學(xué)的理論原則,穴位以節(jié)段性、節(jié)段間及脊髓上的作用為基礎(chǔ)來對內(nèi)臟功能活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。以往研究顯示“足三里”穴區(qū)的傳入沖動主要通過軀體神經(jīng)和血管壁神經(jīng)叢兩條途徑上行,投射到T6-S3脊神經(jīng)節(jié),“內(nèi)關(guān)”穴傳入神經(jīng)元主要位于C6-T1,而支配胃的神經(jīng)節(jié)段位于T5-T9,由此可見胃與足三里穴區(qū)的傳入神經(jīng)元在下胸部及腰部是相互交匯及重疊的部分,而內(nèi)關(guān)穴的傳入神經(jīng)元與胃的傳入神經(jīng)元不在同一神經(jīng)節(jié)段。這就明確的闡述了穴位對內(nèi)臟功能的整體性、超節(jié)段性調(diào)節(jié)作用與整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能完整性有關(guān),尤其與脊髓上的各級中樞的作用密切相關(guān)。脾俞和胃俞均屬于背俞穴,臨床常選用于治療消化道疾病,與胃有著高度的相關(guān)性,對于胃機能活動有著雙向調(diào)節(jié)作用。其神經(jīng)支配節(jié)段分別位于T7-T11和T8-T12,本實驗結(jié)果顯示針刺脾俞及胃俞反應(yīng)性低于內(nèi)關(guān)及足三里,首先從解剖位置的觀點來看,足三里和內(nèi)關(guān)憑借著其與胃傳入神經(jīng)節(jié)段的多處交匯及重疊而對體表刺激產(chǎn)生強烈反應(yīng),脾俞及胃俞僅與胃傳入神經(jīng)節(jié)段有少量重疊,因此作者大膽猜測脾胃俞穴與胃可能存在著中樞以外的傳遞途徑。第二,實驗中觀察到在針刺穴位記錄神經(jīng)元放電的過程中,針刺脾俞和胃俞所產(chǎn)生的神經(jīng)元放電單位都有數(shù)秒乃至十秒的反應(yīng)潛伏期,在30s左右達(dá)到放電的高峰。作者大膽地將這一反應(yīng)歸類于穴位的繼發(fā)信息,即穴位在受到刺激后,激活局部的組織、血管和神經(jīng)等產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì),繼而引起中樞核團(tuán)的反應(yīng)。繼發(fā)信息的特點即為產(chǎn)生反應(yīng)的時間慢,而持續(xù)的時間長。下丘腦作為自主神經(jīng)系統(tǒng)中的高級中樞,在協(xié)調(diào)自主和感覺信息方面發(fā)揮著舉足輕重的作用,而室旁核不僅在下丘腦中占據(jù)了重要的解剖位置,也在下丘腦調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動和內(nèi)分泌活動的功能中扮演了重要的角色。針刺信息作為一個有傳入性功能影響的效應(yīng),在初級神經(jīng)中樞接收到來自體表的針刺信息后,可向更高級的中樞核團(tuán)室旁核傳遞,此類信息到達(dá)室旁核后,激活了其內(nèi)分泌活動等狀態(tài),從而對體表信息進(jìn)行整合處理。大量的實驗研究表明,室旁核在調(diào)節(jié)胃運動中發(fā)揮了重要的作用,其對胃酸分泌、胃運動及胃黏膜損傷均有著明顯的影響。早在20世紀(jì)80年代,Rogers等的研究就已證實,單側(cè)電刺激室旁核可明顯增加胃酸的分泌及增強胃的運動性。而Morrow等的研究亦證實,下丘腦室旁核在微量注射促甲狀腺激素釋放激素后可明顯增強胃的收縮活動。張文文采用室旁核注射催產(chǎn)素的方法,觀察其對胃缺血再灌注損傷的影響,結(jié)果顯示室旁核注射一定劑量催產(chǎn)素后對胃黏膜缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用。李慧采用束縛-浸水應(yīng)激的造模方法制造大鼠胃腸機能紊亂及應(yīng)激性胃黏膜損傷模型,采用辣根過氧化物酶逆行追蹤的方法發(fā)現(xiàn)室旁核在胃機能調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用。張詠梅等采用夾閉大鼠腹腔動脈30min,松開動脈夾讓血流復(fù)灌1h的胃缺血-再灌注損傷的造模方法,觀察下丘腦室旁核進(jìn)行電和化學(xué)刺激后,其對大鼠胃缺血-再灌注損傷的影響及胃缺血-再灌注損傷后下丘腦室旁核內(nèi)c-fos的表達(dá)。結(jié)果顯示在電和化學(xué)刺激室旁核的情況下,胃缺血-再灌注損傷程度減輕,且胃缺血-再灌注損傷使得下丘腦室旁核內(nèi)c-fos表達(dá)增加。Zhang等報道下丘腦室旁核對大鼠應(yīng)激性胃潰瘍有重要的調(diào)節(jié)作用,實驗發(fā)現(xiàn)下丘腦室旁核在接受電或化學(xué)刺激的情況下均可加重應(yīng)激性潰瘍的程度,而電損毀下丘腦室旁核則可減輕潰瘍程度。下丘腦室旁核憑借其豐裕的傳入、傳出纖維,與腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)、孤束核及迷走神經(jīng)背核等組織保持著密切的往返纖維聯(lián)系。神經(jīng)徑路追蹤技術(shù)不斷更新肯定了下丘腦室旁核與孤束核和延髓腹外側(cè)核之間的纖維往返關(guān)系。張詠梅等的實驗研究也證實了損毀大鼠雙側(cè)孤束核,可取消電刺激下丘腦室旁核對胃缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。陳澤斌等則發(fā)現(xiàn)同時損毀家兔室旁核及孤束核可減弱電針內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血的保護(hù)作用,以此說明室旁核與孤束核之間的密切關(guān)系。早在20世紀(jì)80年代,即有報道對大鼠及貓進(jìn)行過實驗觀察,證實下丘腦室旁核與迷走神經(jīng)背核之間有直接的纖維投射。程世斌等證明迷走神經(jīng)背核有纖維投射到下丘腦室旁核,亦有實驗研究稱若干來自藍(lán)斑、背側(cè)延髓迷走復(fù)合體及延髓腹側(cè)的內(nèi)臟感覺、邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)纖維聯(lián)系終止于下丘腦室旁核小細(xì)胞內(nèi)部,因此延髓迷走復(fù)合體與下丘腦室旁核小細(xì)胞之間存在著纖維的雙向投射,其所形成的環(huán)路對下丘腦調(diào)節(jié)內(nèi)臟刺激反應(yīng)起著重要的整合作用。王光明等采用下丘腦室旁核內(nèi)微量注射藥物,胃運動及胃電活動呈劑量依賴性增強,而切除膈下迷走神經(jīng)則可消除此種效應(yīng)。有研究證明,胃在受到傷害性刺激后,孤束核和延髓腹外側(cè)核內(nèi)向下丘腦室旁核投射的神經(jīng)元中有28.2%為FOS陽性細(xì)胞。來自順行和逆行示蹤標(biāo)記的實驗研究證明,下丘腦室旁核和迷走神經(jīng)背核之間存在單突觸的往返纖維聯(lián)系。亦有研究顯示,損毀雙側(cè)迷走神經(jīng)背核后,電刺激下丘腦室旁核,大鼠胃位相性收縮波明顯增強,損毀雙側(cè)迷走神經(jīng)背核后,可阻斷下丘腦室旁核對胃運動的抑制作用,這些信息準(zhǔn)確地透露了經(jīng)下丘腦室旁核整合處理后的胃傷害性刺激可能通過由孤束核和迷走神經(jīng)背核組成的迷走復(fù)合體投射到胃,進(jìn)而參與胃功能調(diào)控的這一事實。圖3為大腦相關(guān)核團(tuán)調(diào)控胃運動的通路。本實驗的研究結(jié)果提示,針刺足三里、內(nèi)關(guān)等穴位的刺激信號經(jīng)脊髓到達(dá)孤束核,經(jīng)孤束核的初步整合后,上行投射激活下丘腦室旁核,體表的刺激信號到達(dá)下丘腦室旁核后,由室旁核-延髓背側(cè)迷走復(fù)合體-迷走神經(jīng)通路進(jìn)行下行投射,經(jīng)迷走神經(jīng)到達(dá)靶器官-胃,以神經(jīng)傳導(dǎo)及神經(jīng)內(nèi)分泌等方式對胃的功能活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。由此可推斷,下丘腦室旁核中存在著對胃擴張刺激和針刺刺激其反應(yīng)的軀