電針通過關元穴傳遞大鼠偽狂犬病毒的機制研究

電針通過關元穴傳遞大鼠偽狂犬病毒的機制研究

自古以來，關元穴一直是中醫(yī)治療女性生殖系統(tǒng)疾病的重要穴位。臨床上，以關元穴為主的針灸團體治療閉經(jīng)綜合征，取得了良好的治療效果。我們課題組在以往開展的“針刺調整女性生殖功能異常的機制研究”中觀察到:下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)超常釋放,垂體激素促黃體激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)分泌增多,外周雌激素水平明顯降低;在給予以“關元”穴為主的一組穴位針刺處理后,下丘腦視前區(qū)β-內啡肽、多巴胺釋放增加,抑制性氨基酸遞質γ-氨基丁酸以及催乳素釋放肽也增加,與此同時,GnRH的超常分泌受到抑制,動物外周血雌二醇水平升高,垂體LH含量明顯降低。然而,針刺的穴位在下腹部,女性生殖內分泌的調節(jié)中樞卻位于下丘腦,針刺信號是如何由下腹部的穴位區(qū)傳遞到下丘腦,從而引起眾多神經(jīng)遞質、神經(jīng)肽的改變?其機制至今尚不清楚。我們在前期工作中應用霍亂毒素B亞單位-辣根過氧化物酶(CB-HRP)示蹤法對大鼠“關元”穴傳入的神經(jīng)節(jié)段分布進行了研究,發(fā)現(xiàn)在大鼠的T11-L3雙側背根神經(jīng)節(jié)中都存在與“關元”穴相關的CB-HRP標記細胞,電針組的標記細胞總數(shù)顯著高于對照組,說明針刺穴位信號傳導途徑與神經(jīng)通路密切相關。但由于該示蹤方法的局限性,未能對針刺信號的傳導進行進一步示蹤。本實驗利用嗜神經(jīng)病毒跨突觸傳遞的特性,進一步研究“關元”穴針刺信號在中樞神經(jīng)內的傳導通路,為“關元”穴針刺信號傳入神經(jīng)中樞提供形態(tài)學依據(jù)。1材料和方法1.1陰道缺失細胞的誘導切除雌性Sprague-Dawley大鼠24只,45日齡左右,180～200g,購自復旦大學實驗動物中心。飼養(yǎng)于12h光照/12h黑暗的環(huán)境中,自由攝食和飲水。經(jīng)陰道涂片選取陰道脫落細胞存在典型的4d周期性變化者,在實驗環(huán)境中適應1周后進行實驗。動物的處理符合實驗動物使用準則,并通過倫理委員會審批。動物隨機分為正常組(NC)、正常加電針組(NC+EA)、去卵巢組(OVX)和去卵巢加電針組(OVX+EA),每組6只。OVX和OVX+EA組在乙醚麻醉下做雙側卵巢切除術,術后3周,連續(xù)4d陰道涂片找不到脫落上皮細胞作為卵巢切除完整的指標。相同條件下喂養(yǎng)4周,NC+EA和OVX+EA組給予電針處理。第3次電針處理結束后6h,各組大鼠同時處死。1.2病毒培養(yǎng)、鑒定與計量本實驗中采用的PRV為PRV-gG--LacZ+株型(由華中農(nóng)業(yè)大學提供),即在野生株型的基礎上缺失gG基因,然后插入LacZ標記基因,該病毒可以在大鼠體內同時進行順行和逆行傳遞。病毒懸液保存在-80℃條件下,直到病毒傳代、滴度測定或注射。病毒傳代與滴度測定時采用豬腎細胞PK15。首先將適量病毒懸液加入長滿單層細胞的細胞瓶內,使其覆蓋細胞單層,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45～60min后,加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)直到75%以上細胞出現(xiàn)病變時,收集病毒,分置于容器內低溫保存。病毒滴度測定在6孔板進行,首先將稀釋不同倍數(shù)的病毒懸液加入長滿單層PK15細胞的6孔板內,然后再覆蓋一層與小牛血清混合的瓊脂糖。當出現(xiàn)適量空斑后,中性紅染色進行計數(shù)。噬斑形成單位(PFU)的計算方法:空斑數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/接種病毒體積。PRV僅注射1次,用微量注射器將10μl(108PFU/ml)的PRV緩慢注入“關元”穴(速度為1μl/min),注射完畢后留針10min。1.3第1次電針處理NC+EA和OVX+EA組分別在注射病毒后30min,在“關元”穴給予第1次電針處理,連續(xù)3d,1次/d,每次30min,在上午8～12點間完成。采用連續(xù)波,刺激頻率為2Hz,強度為2～3mA(韓氏電針儀,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司生產(chǎn)),以動物下肢發(fā)生輕度抖動為度。1.4動物肢體灌注大鼠在7%水合氯醛(1ml/200g)麻醉下,迅速打開胸腔,暴露心臟,經(jīng)左心室插管至升主動脈,剪開右心耳,快速灌入預冷的生理鹽水300ml沖洗,隨后用200ml0.1mol/L磷酸緩沖液(PB)配制的4%中性多聚甲醛(pH7.4)快速固定,當動物肢體伸展后減慢灌注速度,約30min內灌注完畢。在背部從上到下依次鉗斷大鼠顱骨和脊椎骨,取出大腦和脊髓,放入含20%蔗糖的4%多聚甲醛液中固定24h,待組織完全下沉后,浸入30%蔗糖磷酸緩沖液中。分離腦和脊髓,將其制成35μm厚的冠狀位連續(xù)冰凍切片(CM-1900恒冷切片機),分別放在不同標記的24孔板中。1.5羊抗兔二抗prv觀察總體規(guī)劃將切片在兔抗大鼠β-半乳糖苷酶多克隆抗體(英國ABCam公司,工作濃度1∶5000)溶液中,37℃孵育2h,4℃放置24～48h,然后用羊抗兔二抗室溫孵育10min,DAB顯色,無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片(ABC免疫組化試劑盒,晶美生物工程公司)。分別用正常羊血清代替一抗和省略一抗作陰性對照。每張切片觀察全部PRV免疫陽性細胞視野,陽性細胞為棕褐色染色,呈神經(jīng)元胞體狀,有的可見軸突纖維。參照文獻對每只大鼠的PRV免疫陽性細胞核團進行定位,每只大鼠的每個核團取5張切片,對每一個核團的免疫陽性細胞進行計數(shù),取算術平均值。1.6xs軟件各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用Stata7.0軟件處理。多組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析,繼以Bonferroni進行兩兩比較。2結果2.1細胞陽性程度4組大鼠PRV免疫陽性細胞在脊髓節(jié)段分布大體相同,在脊髓的頸部(圖2A、圖2D)、胸部(圖2B、圖2E)、腰部(圖2C、圖2F)的背側角和腹側角均發(fā)現(xiàn)陽性細胞。細胞界限清晰,呈圓形或橢圓形。脊髓背角感染的細胞較小,而腹角感染的細胞較大。2.2核型神經(jīng)結構表達PRV免疫陽性細胞在腦干的分布廣泛,各組無明顯差異,在孤束核、楔束核、巨細胞網(wǎng)狀核、迷走神經(jīng)背核、三叉神經(jīng)脊束核、中縫大核、藍斑、腦橋尾側網(wǎng)狀核、腦橋背蓋網(wǎng)狀核、小細胞網(wǎng)狀核、三叉神經(jīng)主核、三叉神經(jīng)中腦核、斜方體核、旁正中網(wǎng)狀核、外側網(wǎng)狀核、下橄欖核均有表達。2.3ovx對prv免疫陽性細胞的抑制作用PRV免疫陽性細胞在下丘腦主要分布在隔內側核(圖4)、室旁核(圖5)、弓狀核(圖6)、斜角帶核(圖7)、腹內側核(圖8)和視前大細胞亞核(圖9)。4組比較及統(tǒng)計學分析(見圖10)發(fā)現(xiàn):OVX組的PRV免疫陽性細胞在隔內側核、室旁核、弓狀核和斜角帶核的分布明顯減少,在下丘腦腹內側核和視前大細胞亞核幾乎未見表達,與NC、NC+EA組有明顯差異(P<0.05,0.01);但OVX+EA組在上述區(qū)域的PRV免疫陽性細胞表達與OVX組相比明顯增多或者重新出現(xiàn),有統(tǒng)計學意義(P<0.05,0.01);NC+EA組與NC組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。提示:對去卵巢大鼠進行電針處理,可以增加其下丘腦隔內側核、室旁核、弓狀核、腹內側核、斜角帶核和視前大細胞亞核的PRV免疫陽性細胞的表達。2.4海馬和皮質PRV免疫陽性細胞在丘腦腹側核、中央灰質、海馬和皮層也均有表達,且4組間無明顯差異。皮層部的PRV免疫陽性細胞主要集中分布在紋狀區(qū),胞體呈顆粒狀,且軸突清晰可見。3針刺信號的普遍化本實驗采用的PRV-gG--LacZ+是一種嗜神經(jīng)的病毒示蹤劑。利用其嗜神經(jīng)、跨突觸傳遞、特異性傳遞和不易衰減的特點,自20世紀90年代起,國外已將該技術成功用于對支配周圍組織和器官的中樞神經(jīng)結構示蹤的研究中。由于PRV可以在神經(jīng)細胞內進行自我復制,并隨著時間的推移,沿著特定功能的神經(jīng)通路進行傳導,所以其顯示的是一個連續(xù)而動態(tài)的過程。我們在“關元”穴注射該病毒株,PRV陽性感染的區(qū)域即“關元”穴針刺信號經(jīng)過的路徑。一般認為,針刺穴位信號主要通過感覺神經(jīng)通路進行傳導,但并不排斥同時有部分運動神經(jīng)參與的可能性,所以我們在脊髓的背側和腹側角同時觀察到PRV-IR陽性細胞的存在。在預實驗中,我們確定了病毒從“關元”穴傳遞到大腦皮層所需的時間和合適的病毒滴度。在正式實驗中我們把實驗動物分為4組,NC和NC+EA組相比較,以觀察電針對正常大鼠PRV傳導的影響;OVX和OVX+EA組相比較,以觀察在病理狀態(tài)下電針對PRV傳導的影響;NC和OVX組相比較,以觀察正常和病理狀態(tài)下PRV感染的神經(jīng)通路的異同。參考相關文獻資料的統(tǒng)計方法,我們在同時對4組大鼠的陽性細胞進行計數(shù)和比較時,取50%作為核團是否存在PRV免疫陽性細胞的最低標準,即在每組大鼠中多于3只的大鼠在該核團出現(xiàn)PRV免疫陽性細胞,則判定該核團存在陽性表達。根據(jù)上述標準,我們描繪出“關元”穴針刺信號在中樞神經(jīng)內的傳導通路主要分布為:脊髓的腰、胸、頸段的腹側和背側角,腦干的孤束核、巨細胞網(wǎng)狀核、三叉神經(jīng)脊束核、三叉神經(jīng)主核、斜方體核、下橄欖核等,丘腦腹側核,下丘腦室旁核、視交叉部的弓狀核、腹內側核、斜角帶核、視前大細胞亞核,以及皮層等。結合我們在以往實驗中用CB-HRP示蹤法對大鼠“關元”穴傳入的神經(jīng)節(jié)段分布的研究結果,可以認為,針刺“關元”穴后,其針刺信號首先經(jīng)穴區(qū)的軀體神經(jīng)和周圍血管神經(jīng)叢傳入脊神經(jīng)節(jié),然后跨突觸進一步上傳到脊髓、腦干、丘腦、下丘腦和皮層。一直以來,下丘腦被認為是內分泌的調節(jié)中樞,那么下丘腦應該是針刺信號轉換成內分泌信號的一個重要整合部位。同時,根據(jù)傳統(tǒng)神經(jīng)生理學的認識,軀體和感覺信號最終都到達大腦皮層進行整合,再傳導到有關功能中樞,發(fā)揮其特有的功能。在本實驗中,下丘腦以及皮層均可觀察到PRV免疫陽性細胞,那么可以認為,針刺信號可能直接傳導到下丘腦進行整合,也可能先經(jīng)皮層整合后再傳導到下丘腦發(fā)揮其特有的生理、病理功能,或者兩種傳導途徑同時存在。在實驗中發(fā)現(xiàn):NC組和NC+EA組的PRV免疫陽性細胞分布基本相同,表明在正常情況下,“關元”穴的神經(jīng)傳導通路并不受電針作用的影響。同時我們觀察到:在下丘腦,OVX+EA組的免疫陽性細胞數(shù)量與OVX組相比有明顯增加,且在OVX組某些核團缺失的陽性細胞重新出現(xiàn),說明在病理狀態(tài)下,電針可以促使某些神經(jīng)通路結構的恢復,有助于下丘腦發(fā)揮調控作用,提示針刺是一種調整作用。這一效應的可能機制是:第一,電針可以一定程度地提高雌激素水平,促進了對雌激素依賴的某些神經(jīng)結構的改善;第二,電針刺激可能直接增強了神經(jīng)突觸的可塑性,加強了神經(jīng)突觸間的聯(lián)系;第三,電針可能激活了某些神經(jīng)元的功能,更有利于PRV的感染和自我復制。OVX組與NC組相比,下丘腦隔內側核、室旁核、弓狀核、腹內側核、斜角帶核和視前大細胞亞核的PRV免疫陽性細胞明顯減少,甚至個別核團呈陽性細胞缺失,而這些發(fā)生明顯變化的核團都是與內分泌密切相關的。此結果表明:大鼠去除卵巢后,雌激素水平急劇下降,長反饋引起下丘腦神經(jīng)內分泌中樞的變化,原有的神經(jīng)傳導通路改變。與許多文獻報道的位于下丘腦多個區(qū)域內的神經(jīng)結構(樹突密度以及突觸間的聯(lián)系)呈雌激素依賴性、雌激素減少可以引起下丘腦神經(jīng)結構改變相一致。實驗結果中,未在下丘腦外的其