電針通過關(guān)元穴傳遞大鼠偽狂犬病毒的機(jī)制研究

電針通過關(guān)元穴傳遞大鼠偽狂犬病毒的機(jī)制研究

自古以來，關(guān)元穴一直是中醫(yī)治療女性生殖系統(tǒng)疾病的重要穴位。臨床上，以關(guān)元穴為主的針灸團(tuán)體治療閉經(jīng)綜合征，取得了良好的治療效果。我們課題組在以往開展的“針刺調(diào)整女性生殖功能異常的機(jī)制研究”中觀察到:下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)超常釋放,垂體激素促黃體激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)分泌增多,外周雌激素水平明顯降低;在給予以“關(guān)元”穴為主的一組穴位針刺處理后,下丘腦視前區(qū)β-內(nèi)啡肽、多巴胺釋放增加,抑制性氨基酸遞質(zhì)γ-氨基丁酸以及催乳素釋放肽也增加,與此同時(shí),GnRH的超常分泌受到抑制,動(dòng)物外周血雌二醇水平升高,垂體LH含量明顯降低。然而,針刺的穴位在下腹部,女性生殖內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)中樞卻位于下丘腦,針刺信號是如何由下腹部的穴位區(qū)傳遞到下丘腦,從而引起眾多神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽的改變?其機(jī)制至今尚不清楚。我們在前期工作中應(yīng)用霍亂毒素B亞單位-辣根過氧化物酶(CB-HRP)示蹤法對大鼠“關(guān)元”穴傳入的神經(jīng)節(jié)段分布進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在大鼠的T11-L3雙側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中都存在與“關(guān)元”穴相關(guān)的CB-HRP標(biāo)記細(xì)胞,電針組的標(biāo)記細(xì)胞總數(shù)顯著高于對照組,說明針刺穴位信號傳導(dǎo)途徑與神經(jīng)通路密切相關(guān)。但由于該示蹤方法的局限性,未能對針刺信號的傳導(dǎo)進(jìn)行進(jìn)一步示蹤。本實(shí)驗(yàn)利用嗜神經(jīng)病毒跨突觸傳遞的特性,進(jìn)一步研究“關(guān)元”穴針刺信號在中樞神經(jīng)內(nèi)的傳導(dǎo)通路,為“關(guān)元”穴針刺信號傳入神經(jīng)中樞提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1陰道缺失細(xì)胞的誘導(dǎo)切除雌性Sprague-Dawley大鼠24只,45日齡左右,180～200g,購自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于12h光照/12h黑暗的環(huán)境中,自由攝食和飲水。經(jīng)陰道涂片選取陰道脫落細(xì)胞存在典型的4d周期性變化者,在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物的處理符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用準(zhǔn)則,并通過倫理委員會(huì)審批。動(dòng)物隨機(jī)分為正常組(NC)、正常加電針組(NC+EA)、去卵巢組(OVX)和去卵巢加電針組(OVX+EA),每組6只。OVX和OVX+EA組在乙醚麻醉下做雙側(cè)卵巢切除術(shù),術(shù)后3周,連續(xù)4d陰道涂片找不到脫落上皮細(xì)胞作為卵巢切除完整的指標(biāo)。相同條件下喂養(yǎng)4周,NC+EA和OVX+EA組給予電針處理。第3次電針處理結(jié)束后6h,各組大鼠同時(shí)處死。1.2病毒培養(yǎng)、鑒定與計(jì)量本實(shí)驗(yàn)中采用的PRV為PRV-gG--LacZ+株型(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供),即在野生株型的基礎(chǔ)上缺失gG基因,然后插入LacZ標(biāo)記基因,該病毒可以在大鼠體內(nèi)同時(shí)進(jìn)行順行和逆行傳遞。病毒懸液保存在-80℃條件下,直到病毒傳代、滴度測定或注射。病毒傳代與滴度測定時(shí)采用豬腎細(xì)胞PK15。首先將適量病毒懸液加入長滿單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶內(nèi),使其覆蓋細(xì)胞單層,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45～60min后,加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)直到75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí),收集病毒,分置于容器內(nèi)低溫保存。病毒滴度測定在6孔板進(jìn)行,首先將稀釋不同倍數(shù)的病毒懸液加入長滿單層PK15細(xì)胞的6孔板內(nèi),然后再覆蓋一層與小牛血清混合的瓊脂糖。當(dāng)出現(xiàn)適量空斑后,中性紅染色進(jìn)行計(jì)數(shù)。噬斑形成單位(PFU)的計(jì)算方法:空斑數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/接種病毒體積。PRV僅注射1次,用微量注射器將10μl(108PFU/ml)的PRV緩慢注入“關(guān)元”穴(速度為1μl/min),注射完畢后留針10min。1.3第1次電針處理NC+EA和OVX+EA組分別在注射病毒后30min,在“關(guān)元”穴給予第1次電針處理,連續(xù)3d,1次/d,每次30min,在上午8～12點(diǎn)間完成。采用連續(xù)波,刺激頻率為2Hz,強(qiáng)度為2～3mA(韓氏電針儀,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司生產(chǎn)),以動(dòng)物下肢發(fā)生輕度抖動(dòng)為度。1.4動(dòng)物肢體灌注大鼠在7%水合氯醛(1ml/200g)麻醉下,迅速打開胸腔,暴露心臟,經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,剪開右心耳,快速灌入預(yù)冷的生理鹽水300ml沖洗,隨后用200ml0.1mol/L磷酸緩沖液(PB)配制的4%中性多聚甲醛(pH7.4)快速固定,當(dāng)動(dòng)物肢體伸展后減慢灌注速度,約30min內(nèi)灌注完畢。在背部從上到下依次鉗斷大鼠顱骨和脊椎骨,取出大腦和脊髓,放入含20%蔗糖的4%多聚甲醛液中固定24h,待組織完全下沉后,浸入30%蔗糖磷酸緩沖液中。分離腦和脊髓,將其制成35μm厚的冠狀位連續(xù)冰凍切片(CM-1900恒冷切片機(jī)),分別放在不同標(biāo)記的24孔板中。1.5羊抗兔二抗prv觀察總體規(guī)劃將切片在兔抗大鼠β-半乳糖苷酶多克隆抗體(英國ABCam公司,工作濃度1∶5000)溶液中,37℃孵育2h,4℃放置24～48h,然后用羊抗兔二抗室溫孵育10min,DAB顯色,無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片(ABC免疫組化試劑盒,晶美生物工程公司)。分別用正常羊血清代替一抗和省略一抗作陰性對照。每張切片觀察全部PRV免疫陽性細(xì)胞視野,陽性細(xì)胞為棕褐色染色,呈神經(jīng)元胞體狀,有的可見軸突纖維。參照文獻(xiàn)對每只大鼠的PRV免疫陽性細(xì)胞核團(tuán)進(jìn)行定位,每只大鼠的每個(gè)核團(tuán)取5張切片,對每一個(gè)核團(tuán)的免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),取算術(shù)平均值。1.6xs軟件各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用Stata7.0軟件處理。多組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析,繼以Bonferroni進(jìn)行兩兩比較。2結(jié)果2.1細(xì)胞陽性程度4組大鼠PRV免疫陽性細(xì)胞在脊髓節(jié)段分布大體相同,在脊髓的頸部(圖2A、圖2D)、胸部(圖2B、圖2E)、腰部(圖2C、圖2F)的背側(cè)角和腹側(cè)角均發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞。細(xì)胞界限清晰,呈圓形或橢圓形。脊髓背角感染的細(xì)胞較小,而腹角感染的細(xì)胞較大。2.2核型神經(jīng)結(jié)構(gòu)表達(dá)PRV免疫陽性細(xì)胞在腦干的分布廣泛,各組無明顯差異,在孤束核、楔束核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核、迷走神經(jīng)背核、三叉神經(jīng)脊束核、中縫大核、藍(lán)斑、腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核、腦橋背蓋網(wǎng)狀核、小細(xì)胞網(wǎng)狀核、三叉神經(jīng)主核、三叉神經(jīng)中腦核、斜方體核、旁正中網(wǎng)狀核、外側(cè)網(wǎng)狀核、下橄欖核均有表達(dá)。2.3ovx對prv免疫陽性細(xì)胞的抑制作用PRV免疫陽性細(xì)胞在下丘腦主要分布在隔內(nèi)側(cè)核(圖4)、室旁核(圖5)、弓狀核(圖6)、斜角帶核(圖7)、腹內(nèi)側(cè)核(圖8)和視前大細(xì)胞亞核(圖9)。4組比較及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見圖10)發(fā)現(xiàn):OVX組的PRV免疫陽性細(xì)胞在隔內(nèi)側(cè)核、室旁核、弓狀核和斜角帶核的分布明顯減少,在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和視前大細(xì)胞亞核幾乎未見表達(dá),與NC、NC+EA組有明顯差異(P<0.05,0.01);但OVX+EA組在上述區(qū)域的PRV免疫陽性細(xì)胞表達(dá)與OVX組相比明顯增多或者重新出現(xiàn),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,0.01);NC+EA組與NC組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。提示:對去卵巢大鼠進(jìn)行電針處理,可以增加其下丘腦隔內(nèi)側(cè)核、室旁核、弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、斜角帶核和視前大細(xì)胞亞核的PRV免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)。2.4海馬和皮質(zhì)PRV免疫陽性細(xì)胞在丘腦腹側(cè)核、中央灰質(zhì)、海馬和皮層也均有表達(dá),且4組間無明顯差異。皮層部的PRV免疫陽性細(xì)胞主要集中分布在紋狀區(qū),胞體呈顆粒狀,且軸突清晰可見。3針刺信號的普遍化本實(shí)驗(yàn)采用的PRV-gG--LacZ+是一種嗜神經(jīng)的病毒示蹤劑。利用其嗜神經(jīng)、跨突觸傳遞、特異性傳遞和不易衰減的特點(diǎn),自20世紀(jì)90年代起,國外已將該技術(shù)成功用于對支配周圍組織和器官的中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)示蹤的研究中。由于PRV可以在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制,并隨著時(shí)間的推移,沿著特定功能的神經(jīng)通路進(jìn)行傳導(dǎo),所以其顯示的是一個(gè)連續(xù)而動(dòng)態(tài)的過程。我們在“關(guān)元”穴注射該病毒株,PRV陽性感染的區(qū)域即“關(guān)元”穴針刺信號經(jīng)過的路徑。一般認(rèn)為,針刺穴位信號主要通過感覺神經(jīng)通路進(jìn)行傳導(dǎo),但并不排斥同時(shí)有部分運(yùn)動(dòng)神經(jīng)參與的可能性,所以我們在脊髓的背側(cè)和腹側(cè)角同時(shí)觀察到PRV-IR陽性細(xì)胞的存在。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們確定了病毒從“關(guān)元”穴傳遞到大腦皮層所需的時(shí)間和合適的病毒滴度。在正式實(shí)驗(yàn)中我們把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組,NC和NC+EA組相比較,以觀察電針對正常大鼠PRV傳導(dǎo)的影響;OVX和OVX+EA組相比較,以觀察在病理狀態(tài)下電針對PRV傳導(dǎo)的影響;NC和OVX組相比較,以觀察正常和病理狀態(tài)下PRV感染的神經(jīng)通路的異同。參考相關(guān)文獻(xiàn)資料的統(tǒng)計(jì)方法,我們在同時(shí)對4組大鼠的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和比較時(shí),取50%作為核團(tuán)是否存在PRV免疫陽性細(xì)胞的最低標(biāo)準(zhǔn),即在每組大鼠中多于3只的大鼠在該核團(tuán)出現(xiàn)PRV免疫陽性細(xì)胞,則判定該核團(tuán)存在陽性表達(dá)。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn),我們描繪出“關(guān)元”穴針刺信號在中樞神經(jīng)內(nèi)的傳導(dǎo)通路主要分布為:脊髓的腰、胸、頸段的腹側(cè)和背側(cè)角,腦干的孤束核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核、三叉神經(jīng)脊束核、三叉神經(jīng)主核、斜方體核、下橄欖核等,丘腦腹側(cè)核,下丘腦室旁核、視交叉部的弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、斜角帶核、視前大細(xì)胞亞核,以及皮層等。結(jié)合我們在以往實(shí)驗(yàn)中用CB-HRP示蹤法對大鼠“關(guān)元”穴傳入的神經(jīng)節(jié)段分布的研究結(jié)果,可以認(rèn)為,針刺“關(guān)元”穴后,其針刺信號首先經(jīng)穴區(qū)的軀體神經(jīng)和周圍血管神經(jīng)叢傳入脊神經(jīng)節(jié),然后跨突觸進(jìn)一步上傳到脊髓、腦干、丘腦、下丘腦和皮層。一直以來,下丘腦被認(rèn)為是內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)中樞,那么下丘腦應(yīng)該是針刺信號轉(zhuǎn)換成內(nèi)分泌信號的一個(gè)重要整合部位。同時(shí),根據(jù)傳統(tǒng)神經(jīng)生理學(xué)的認(rèn)識,軀體和感覺信號最終都到達(dá)大腦皮層進(jìn)行整合,再傳導(dǎo)到有關(guān)功能中樞,發(fā)揮其特有的功能。在本實(shí)驗(yàn)中,下丘腦以及皮層均可觀察到PRV免疫陽性細(xì)胞,那么可以認(rèn)為,針刺信號可能直接傳導(dǎo)到下丘腦進(jìn)行整合,也可能先經(jīng)皮層整合后再傳導(dǎo)到下丘腦發(fā)揮其特有的生理、病理功能,或者兩種傳導(dǎo)途徑同時(shí)存在。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):NC組和NC+EA組的PRV免疫陽性細(xì)胞分布基本相同,表明在正常情況下,“關(guān)元”穴的神經(jīng)傳導(dǎo)通路并不受電針作用的影響。同時(shí)我們觀察到:在下丘腦,OVX+EA組的免疫陽性細(xì)胞數(shù)量與OVX組相比有明顯增加,且在OVX組某些核團(tuán)缺失的陽性細(xì)胞重新出現(xiàn),說明在病理狀態(tài)下,電針可以促使某些神經(jīng)通路結(jié)構(gòu)的恢復(fù),有助于下丘腦發(fā)揮調(diào)控作用,提示針刺是一種調(diào)整作用。這一效應(yīng)的可能機(jī)制是:第一,電針可以一定程度地提高雌激素水平,促進(jìn)了對雌激素依賴的某些神經(jīng)結(jié)構(gòu)的改善;第二,電針刺激可能直接增強(qiáng)了神經(jīng)突觸的可塑性,加強(qiáng)了神經(jīng)突觸間的聯(lián)系;第三,電針可能激活了某些神經(jīng)元的功能,更有利于PRV的感染和自我復(fù)制。OVX組與NC組相比,下丘腦隔內(nèi)側(cè)核、室旁核、弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、斜角帶核和視前大細(xì)胞亞核的PRV免疫陽性細(xì)胞明顯減少,甚至個(gè)別核團(tuán)呈陽性細(xì)胞缺失,而這些發(fā)生明顯變化的核團(tuán)都是與內(nèi)分泌密切相關(guān)的。此結(jié)果表明:大鼠去除卵巢后,雌激素水平急劇下降,長反饋引起下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌中樞的變化,原有的神經(jīng)傳導(dǎo)通路改變。與許多文獻(xiàn)報(bào)道的位于下丘腦多個(gè)區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)(樹突密度以及突觸間的聯(lián)系)呈雌激素依賴性、雌激素減少可以引起下丘腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)改變相一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,未在下丘腦外的其