促性腺激素抑制激素的研究

促性腺激素抑制激素的研究

促進(jìn)腺激素激素（gnih）是2000年首次發(fā)現(xiàn)的一種含有12個(gè)氨基酸的精氨酸苯丙胺（rci）神經(jīng)武器。例如，gnih的神經(jīng)元細(xì)胞主要位于腦的旁邊。由于它能抑制山羊背部前葉細(xì)胞（pgi）激素的釋放，因此將其稱為激素激素抑制激素。隨后,克隆了其受體,并對GnIH及其受體在下丘腦-垂體-性腺軸的分布定位、生理功能、作用機(jī)制等進(jìn)行了研究。在哺乳動(dòng)物也發(fā)現(xiàn)了GnIH的類似物,有3種,其C端具有RF酰胺,稱RF酰胺相關(guān)肽(RFRP),具有與GnIH類似的作用。GnIH的發(fā)現(xiàn),是對動(dòng)物生殖調(diào)控研究的一個(gè)新突破。1合成rf酰胺fmrf-nh的活性化合物早在30年前,在軟體動(dòng)物(蛤)的神經(jīng)節(jié)發(fā)現(xiàn)了具有心興奮作用的神經(jīng)肽-苯丙氨酰-甲硫氨酰-精氨酰-苯丙酰胺(FMRF酰胺)(Price等,1977),隨后在其他無脊椎動(dòng)物發(fā)現(xiàn)了C端具有RF酰胺模體的神經(jīng)肽,Dockray等人(1983)首先在脊椎動(dòng)物(雞)發(fā)現(xiàn)了RF酰胺(LPLRF酰胺)肽。一些研究發(fā)現(xiàn)FMRF酰胺陽性神經(jīng)元投射至垂體附近的下丘腦區(qū),提示他們具有調(diào)節(jié)垂體功能的作用。因此,Tsutsui等人推測鳥的下丘腦可能含有調(diào)節(jié)垂體功能的RF酰胺肽,并于2000年用HPLC和競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)從日本鵪鶉腦內(nèi)分離提純了RF酰胺肽,測定了其氨基酸序列,確定為C端含有RF酰胺的12肽(SIKPSAYLPLRF-NH2)。以后發(fā)現(xiàn)該肽分布于鵪鶉的下丘腦-垂體系統(tǒng),并呈劑量依賴性降低培養(yǎng)的垂體前葉促性腺激素的釋放,將其命名為促性腺激素抑制激素(GnIH)。2雞的rfrp基因及結(jié)構(gòu)鵪鶉的GnIH為12肽,其氨基酸序列為Ser-Ile-Lys-Pro-Ser-Ala-Tyr-Leu-Pro-Leu-Arg-Phe。GnIH由前體肽裂解產(chǎn)生,其前體肽含有173個(gè)氨基酸殘基,可編碼1個(gè)GnIH和2個(gè)GnIH相關(guān)肽(GnIH-RP-1和GnIH-RP-2),GnIH相關(guān)肽(GnIH-RP)C端含有LPXRF(X為L或Q)酰胺(圖1)。所有這些肽的序列具有甘氨酸C端酰胺化信號和兩端單堿基內(nèi)蛋白水解(endoproteolytic)位點(diǎn)。Gambel白冠麻雀的GnIH前體也由173個(gè)氨基酸組成,編碼1個(gè)GnIH和2個(gè)C端含有LPXRF(X為L或Q)酰胺的GnIH-RP。盡管鵪鶉與麻雀GnIH前體的同源性為66%,但GnIH、GnIH-RP-1和GnIH-RP-2C端的結(jié)構(gòu)均相同。Ikemoto和Park(2005)克隆了雞的RF酰胺相關(guān)肽(GnIH),其cDNA含971bp,包括5′-UTR(38個(gè)核苷酸)、ORF(519個(gè)核苷酸)、中止密碼codon(TGA)和3′-UTR(411個(gè)核苷酸)。ORF可編碼含有173個(gè)氨基酸的RFRP前體(prepro-RFRP)。翻譯的起始點(diǎn)為+39~+41位點(diǎn)ATG,3′-UTR在多A尾的上游含有標(biāo)準(zhǔn)的多腺苷酸polyadenylation信號(AATAAA)。雞的RFRP也包括GnIH、GnIH-RP-1和GnIH-RP-2三部分,其GnIH的序列與鵪鶉的僅有第3位上氨基酸不同(SIRPSAYLPLRF-NH2),每一部分均有酰胺化/蛋白水解加工信號(甘氨酸和單堿基殘基)。雞的RFRP由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成,所有3個(gè)5′-和3′-分裂位點(diǎn)均含有相同的5′-GT和3′-AG,2個(gè)內(nèi)含子在ORF內(nèi)的位置與人和大鼠的相似,其長度分別為1735和874bp。Kriegsfeld等人(2006)克隆了敘利亞倉鼠GnIH前體部分序列,含有2個(gè)LPXRF(X為L或Q)序列,與小鼠和大鼠RFRP及白冠麻雀和鵪鶉GnIH的同源性分別為81%、77%、43%和42%。Hinuma等通過genedatabase研究發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物GnIH的類似結(jié)構(gòu)和受體,人的基因至少可編碼3個(gè)RF酰胺相關(guān)肽(hRFRP-1~3),這些肽及其受體(OT7T022)在大鼠的下丘腦表達(dá),給大鼠腦室注射hRFRP-1可以增加催乳素的分泌。Sawada等克隆了金魚的LPLRF酰胺肽,其前體含197個(gè)氨基酸殘基,可產(chǎn)生3種C端具有LPXRF(X為L或Q)酰胺的肽,即gfLPXRFa-1、gfLPXRFa-2和gfLPXRFa-3,后者的序列為SGTGLSATLPQRF-NH2。Ukena等報(bào)道了青蛙C端具有LPXRF酰胺的神經(jīng)肽,由于他可刺激生長激素的分泌,命名為生長激素釋放肽(fGRP),其前體可分裂產(chǎn)生fGRP及其相關(guān)肽(fGRP-RP-1~3),fGRP-RP-2可刺激催乳素的釋放,但對促性腺激素?zé)o影響。3gnih-ir+dmh-神經(jīng)元/細(xì)胞的表達(dá)免疫組化研究發(fā)現(xiàn),鵪鶉的GnIH免疫陽性神經(jīng)元主要分布于下丘腦室旁核(PVN),為腹側(cè)部的小細(xì)胞;一些散在的小神經(jīng)元也見于隔區(qū)。GnIH的分布無明顯的性別差異。原位雜交研究表明GnIH在下丘腦室旁核表達(dá)。但免疫陽性纖維在間腦和中腦廣泛分布,致密的免疫陽性纖維網(wǎng)絡(luò)見于腹側(cè)舊紋狀體、隔區(qū)、視前區(qū)、下丘腦和視頂蓋,最顯著的纖維見于下丘腦的正中隆起(ME)和延髓的迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核。在麻雀,GnIH免疫陽性神經(jīng)元分布于下丘腦室旁核,免疫陽性纖維見于多個(gè)腦區(qū),包括正中隆起和腦干。繁殖季節(jié)末期鳥的GnIH神經(jīng)元比其他時(shí)期的大,與該神經(jīng)肽調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖的作用一致。雙標(biāo)記和共聚焦技術(shù)研究指出GnIH纖維和GnRH-1神經(jīng)元在視前區(qū)密切接觸,GnIH和GnRH-1纖維在正中隆起接觸,與該肽調(diào)節(jié)垂體促性腺激素的作用一致。Ubuka等報(bào)道歐掠鳥(starling)GnIH神經(jīng)元位于下丘腦室旁核,纖維末梢存在于正中隆起外層及分別存在GnRH-I和GnRH-Ⅱ神經(jīng)元胞體的視前區(qū)和中腦;GnIH終末與GnRH-I和GnRH-Ⅱ神經(jīng)元接觸;在GnRH-I和GnRH-Ⅱ神經(jīng)元上有GnIH受體mRNA表達(dá)。這些結(jié)果提示GnIH可在腦水平通過GnRH調(diào)節(jié)促性腺激素的釋放。Kawano等人報(bào)導(dǎo)日本草原(牧場)蜥蜴的GnIH-ir細(xì)胞位于伏隔核、室旁核和延髓上部,來自室旁核的GnIH-ir纖維與室旁器官(PVO)血清素(5-羥色胺)樣神經(jīng)元的外側(cè)突接觸。Kriegsfeld等報(bào)道倉鼠、大鼠和小鼠的GnIH免疫陽性(GnIH-ir)細(xì)胞體集中在下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DMH),大多數(shù)為雙極和三極細(xì)胞,面積為(622.52±17.81)μm2,細(xì)胞數(shù)和纖維分布在倉鼠無性別差異。在其他腦區(qū)未見免疫陽性細(xì)胞。原位雜交研究發(fā)現(xiàn)GnIHmRNA僅在DMH表達(dá)。GnIH-ir纖維和終末在GnRH神經(jīng)元和纖維集中的腦中線區(qū)普遍存在,也在不含GnRH神經(jīng)元和纖維的許多腦區(qū)存在,向前投射至中線、邊緣區(qū)(隔區(qū)、視前區(qū)、杏仁核和終紋床核),向前腹側(cè)投射至下丘腦前區(qū)和弓狀核,向后投射可達(dá)后腦和管周灰質(zhì),稀疏的GnIH-ir纖維見于正中隆起(ME),大多數(shù)位于靠近第3腦室的內(nèi)層。雙標(biāo)記和共聚焦顯微鏡研究發(fā)現(xiàn),在母倉鼠,大于40%的GnRH細(xì)胞接受來自GnIH系統(tǒng)的投射,除統(tǒng)計(jì)的軸-體接觸外,還見到許多軸-樹接觸。在大鼠和小鼠也觀察到類似到結(jié)果。再則,母倉鼠的GnIH-ir細(xì)胞(39.41±2.06)%表達(dá)性腺類固醇受體(ERα),雄倉鼠的GnIH-ir細(xì)胞表達(dá)AR。此外,Ubuka等研究了日本鵪鶉GnIH的發(fā)育變化,發(fā)現(xiàn)GnIH前體mRNA在10日齡胚胎(E10)的間腦表達(dá),在孵出前的E17顯著增加。GnIH也在E10的間腦表達(dá),在接近孵出時(shí)顯著增加。隨后間腦的GnIH含量臨時(shí)降低,以后再次逐漸增加直到成年。GnIH-ir神經(jīng)元在E10位于室旁核,但GnIH-ir纖維未伸至正中隆起。在E17,室旁核的GnIH-ir神經(jīng)元增加,GnIH-ir纖維與成年一樣伸至ME的外側(cè)。這提示GnIH在孵出前后作為鳥類下丘腦促性腺激素釋放的調(diào)節(jié)者而發(fā)揮作用。Ciccone等報(bào)導(dǎo),青年母雞(30周)與老齡母雞(60周)下丘腦總的GnIH和GnRHmRNA無差異。4rpr-cdna的結(jié)構(gòu)GnIH通過其受體發(fā)揮作用。Yin等根據(jù)大鼠RFRP(鳥類GnIH的同祖肽)受體的序列設(shè)計(jì)克隆了日本鵪鶉的GnIH受體,證明其為具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR),與GnIH和GnIH-RP有高的結(jié)合力。鵪鶉GnIH受體長1479bp,ORP為1197bp,分子量為45.7ku,編碼399個(gè)氨基酸殘基。GnIH受體mRNA在鵪鶉的垂體、大腦、間腦、中腦和脊髓表達(dá),在間腦、中腦和脊髓含量較高。結(jié)果提示GnIH通過其受體直接作用于垂體調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌。Ikemoto和Park報(bào)導(dǎo)雞的RFRP(GnIH)有兩種受體(RFRPR和NPFFR),RFRPRcDNA由1442bp組成,包括5′-UTR(32個(gè)核苷酸)、ORF(1197個(gè)核苷酸,編碼399個(gè)氨基酸殘基)、中止密碼codon(TGA)和3′-UTR(210個(gè)核苷酸)。翻譯的起始點(diǎn)與其他動(dòng)物RFRPR的基本相似,3′-UTR在多A尾上游含有單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的AATAAApolyadenylation信號。NPFFRcDNA由1524bp組成,包括5′-UTR(77個(gè)核苷酸)、ORF(1266個(gè)核苷酸,編碼422個(gè)氨基酸殘基)、中止密碼codon(TGA)和3′-UTR(178個(gè)核苷酸)。翻譯的起始點(diǎn)與其他動(dòng)物NPFFR的基本相似,3′-UTR在多A尾上游含有AATAAA的變異體。RFRPR和NPFFR屬于GPCR,為rhodossin/β腎上腺素能受體樣受體(GPCR家族A)成員,但克隆的受體不具有GPCR家族A的結(jié)構(gòu)特征,TM3和第2細(xì)胞內(nèi)環(huán)(IC2)結(jié)合處保守的DYR模體修飾為ERF(RFRPR)和DRF(NPFFR)。RFRPR和NPFFR均由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成,除NPFFR的第1個(gè)內(nèi)含子外,所有內(nèi)含子位于ORF,RFRPR和NPFFR的第2和第3個(gè)內(nèi)含子分別位于第1個(gè)細(xì)胞外環(huán)(EC1)和IC2。RFRPR主要在垂體表達(dá),在間腦、端腦、視頂蓋和嗅球也表達(dá)。NPFFR在多種組織表達(dá),包括間腦、垂體、端腦、視頂蓋、小腦、嗅球、延髓、脊髓、眼球、卵巢、睪丸、心房、心室、肝、腎上腺、脾。Bently等發(fā)現(xiàn)雞GnIH的結(jié)合點(diǎn)在中腦為GnRH-Ⅱ神經(jīng)元或靠近他,在正中隆起靠近GnRH-Ⅰ末梢。Maddineni等報(bào)導(dǎo)GnIH受體(GnIHR)mRNA在雞的睪丸和卵巢(膜細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層)表達(dá),prehierarchial卵泡GnIHRmRNA的量高于排卵前的卵泡,性成熟雞卵巢GnIHRmRNA的量比性未成熟雞卵巢顯著降低,用雌二醇(E2)和/或孕酮(P4)處理性未成熟雞顯著降低卵巢GnIHRmRNA的豐度。提示GnIHR影響卵泡的成熟。5生理功能研究GnIH及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)和多種組織分布,表明他具有多種生理功能,但目前僅對其參與生殖調(diào)控的作用研究較多,其他作用也在逐步進(jìn)行研究。5.1gnih作促性腺激素生物合成因素GnIH在體內(nèi)、外均抑制促性腺激素的分泌。GnRH與原代培養(yǎng)的鵪鶉垂體前葉細(xì)胞作用100min后,呈劑量依賴性顯著抑制LH的釋放,其閾值濃度范圍為10-9~10-8mol/L。對FSH的釋放有類似的趨勢,但作用不顯著;對PRL的釋放無作用。給麻雀注射GnIH(2min)能快速減少血漿LH水平,同時(shí)注射GnIH和雞的cGnRH-I,能降低GnRH誘導(dǎo)的血漿LH的升高。給去卵巢倉鼠腦室或外周注射GnIH,能快速減少LH濃度,最有效劑量的抑制作用可維持30min。這些結(jié)果表明,GnIH可作為鳥類和哺乳動(dòng)物促性腺激素的抑制因子。GnIH可抑制促性腺激素的生物合成。給短期培養(yǎng)(120min)的成年雞垂體塊添加GnIH抑制LH和FSH的釋放,抑制共同的α和FSHβ促性腺激素亞單位mRNA的表達(dá),對LHβ亞單位mRNA無影響。經(jīng)過滲透泵給成年公鵪鶉連續(xù)2周給予GnIH,呈劑量依賴性降低促性腺激素共同的α和LHβ亞單位mRNA的表達(dá),血漿LH和睪酮濃度也呈劑量依賴性降低。此外,也誘導(dǎo)睪丸的凋亡,降低睪丸的生精活動(dòng)。在未成年鳥,連續(xù)2周每日給予GnIH抑制正常的睪丸生長,升高血漿睪酮濃度。給予GnIH后也出現(xiàn)對青年鳥換毛的抑制作用。這表明GnIH通過降低促性腺激素的合成和釋放抑制性腺的發(fā)育和維持。GnIH對動(dòng)物的性行為也有一定的影響。給雌鳥中樞注射GnIH30min之后,其交配請求行為比對照組顯著減少。5.2gnih、gnih-rp-2對雞的攝食影響GnIH具有促進(jìn)動(dòng)物攝食的作用。Tachibana等人報(bào)導(dǎo),給雞腦室內(nèi)注射GnIH、GnIH-RP-1和GnIH-RP-2顯著刺激雞的攝食,GnIH抗血清抑制禁食引起的攝食,但不改變自由攝食條件下的攝食。這些結(jié)果表明GnIH及其相關(guān)肽為雞腦內(nèi)源性的增食因子。6gnih對大鼠血清anh的調(diào)節(jié)作用關(guān)于GnIH調(diào)控動(dòng)物生殖的作用機(jī)制,可能有幾種方式。一是GnIH在垂體水平影響促性腺激素的合成和釋放。在鵪鶉的垂體有GnIH受體,GnIH在體內(nèi)、外抑制LH的釋放,抑制促性腺激素共同的α亞單位及LH和FSHβ亞單位的合成。上述結(jié)果均可說明這一點(diǎn)。二是GnIH在下丘腦水平通過GnRH調(diào)節(jié)生殖活動(dòng)。在倉鼠的GnIH免疫陽性細(xì)胞上存在性腺類固醇激素受體,GnRH細(xì)胞或纖維與GnIH纖維接觸,提示他接受CnIH的直接投射,進(jìn)而通過GnRH影響LH和FSH的分泌。在鳥類,GnIH纖維也與GnRH細(xì)