知母中總皂苷提取工藝的研究

知母中總皂苷提取工藝的研究

知母是百合科植物知母的母親。它對清熱、腹瀉、入液和干燥也很有效。最近有研究表明,知母皂苷元還有抗衰老、提高記憶力及學(xué)習(xí)能力等藥理活性,具有很高的開發(fā)價值。知母主要成分為甾體皂苷,已知的皂苷有AⅠ、AⅡ、AⅢ、AⅣ、BⅠ、BⅡ。皂苷元主要是菝葜皂苷元(Sarsasa-pogenin),且其含量較高,為此作者以知母中菝葜皂苷元為定量檢測指標(biāo),采用HPLC法測定菝葜皂苷元的含量,并以正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化知母中總皂苷的提取工藝,報道如下。1材料和機(jī)器1.1知母、帶樣、對照品、儀器知母藥材粗粉(購于鄭州,經(jīng)河南省中藥研究所有關(guān)專家鑒定為知母的干燥根莖),菝葜皂苷元對照品(中國生物制品鑒定所提供),甲醇和乙腈(色譜純),其他化學(xué)試劑均為分析純。1.2p系統(tǒng)、hypersil18柱及超聲儀RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);高效液相色譜LC-10ATVP系統(tǒng)(日本SHIMADZU公司),HypersilC18柱(2.5μm,4.6mm×200mm)(大連依利特科學(xué)儀器有限公司),AS2060超聲儀(AUTOSCIENCE);數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4(國華電器有限公司)。2方法和結(jié)果2.1母總皂苷的提取精密稱取知母干燥粗粉適量,置索氏提取器中,加適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇數(shù)倍,于100℃水浴中回流提取數(shù)小時,濃縮至約50mL,用石油醚萃取3次(首次20mL,以后10mL/次)脫脂,再用正丁醇萃取4次(首次20mL,以后10mL/次),合并正丁醇液,揮干得知母總皂苷。2.2-關(guān)于棗林素含量的測定2.2.1皂苷元的測定在按2.1提取得到的知母總皂苷中加入適量含2mol/L鹽酸、體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇,再加入一定量的苯于100℃水浴中回流水解3h,冷至室溫,分出苯層,酸層再用苯萃取4次(首次40mL,以后30mL/次),合并萃取液,揮干,用甲醇溶解并定容至25mL,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液10mL置蒸發(fā)皿中,蒸干,殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ莸?mL,作為供試液,用微孔濾膜過濾后,精密吸取續(xù)濾液10μL,用高效液相色譜法測定菝葜皂苷元的含量。2.2.2流動相rid-10aHypersilC18柱(2.5μm,4.6mm×200mm)。流動相,含體積分?jǐn)?shù)為5%水的乙腈。RID-10A檢測器,流速為1.0mL/min,柱溫為25℃。在該色譜條件下,菝葜皂苷元可完全分離。2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)樣,測定峰面積,加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)樣,線性回歸標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)以下簡稱,對于進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線,分精密稱取菝葜皂苷元對照品10.00mg,用甲醇溶解并定容至5mL,然后稀釋成每mL含菝葜皂苷元0.10mg,0.30mg,0.50mg,0.70mg,0.90mg和1.10mg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.2.2所述色譜條件進(jìn)樣,每次10μL,測定其峰面積,將峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明菝葜皂苷元的甲醇溶液在0.10～1.10g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為A=99839C+903(r=0.9998)。2.2.4進(jìn)樣次數(shù)和峰面積按供試品的制備方法制備供試品溶液1份,按2.2.2所述色譜條件進(jìn)樣,每次10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,峰面積的均值為118868.81±249.03,RSD為2.10%;于不同時間進(jìn)樣,則樣品含量的均值為1.08±0.04,RSD為3.39%。2.2.5加樣回收率和rsd精密稱取知母干燥粗粉7份,按供試品的制備方法制備供試品溶液7份,按2.2.2所述色譜條件進(jìn)樣,每次10μL,回收率為(98.00±3.43)%,RSD為3.62%。2.3皂苷元含量測定按正交設(shè)計(jì)表L9(33)安排實(shí)驗(yàn),計(jì)算菝葜皂苷元含量。結(jié)果見表2。由表2可知最佳提取條件為A1B1C1,即:體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇、固液比1:10、提取時間4h。3有機(jī)溶劑萃取對皂苷元含量的影響作者于正交實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn),考察了提取方法對知母中總皂苷提取率和菝葜皂苷元含量的影響,結(jié)果表明索氏提取法較乙醇回流提取法提取效果好,故本研究中采用索氏提取法。在進(jìn)行菝葜皂苷元的含量測定時,考察了水解工藝如萃取試劑,萃取次數(shù)及水解時加入萃取試劑(保護(hù)劑)等因素對菝葜皂苷元含量的影響,結(jié)果表明用苯作萃取劑,萃取4次,并在水解時加入苯可明顯提高供試液中菝葜皂苷元的含量。中國藥典(2005版)采用的分析方法中用NaOH調(diào)pH后蒸干藥液,用溶劑溶解,由于蒸干后鹽類物質(zhì)較多,難以用有機(jī)溶劑完全溶解,故所測樣品含量較低,難以完全反映知母中皂苷元的含量;本研究中作者用有機(jī)溶劑萃取水解的皂苷元,并對知母總皂苷提取條件進(jìn)行優(yōu)選,采用高效液相色譜法對水解產(chǎn)物中的菝葜皂苷元進(jìn)行定量分析,所測樣品含量高,能較完全