樹脂法純化無梗五加果多糖的研究

樹脂法純化無梗五加果多糖的研究

非莖五加[a.sessilyzerisim.]是五加科五加科的一種重要藥物，具有悠久的醫(yī)療歷史。目前,國外對無梗五加根莖以及果實(shí)中的成分進(jìn)行研究且已從中分離出一些化學(xué)成分,但國內(nèi)對無梗五加果實(shí)的研究還少。據(jù)報(bào)道,無梗五加果多糖具有抗腫瘤作用,而且與其增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能有關(guān)。有研究表明,無梗五加果多糖具有抗疲勞、耐缺氧、保肝以及增強(qiáng)免疫力的生物活性功能,這為無梗五加果資源的開發(fā)利用及其多糖的研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。多糖的傳統(tǒng)分離純化步驟復(fù)雜,需要大量的有機(jī)溶劑,繁瑣費(fèi)時(shí),易破壞多糖活性,造成多糖損失。本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹脂法,對其脫色、脫蛋白及多糖損失進(jìn)行研究,代替多步過程,為無梗五加果多糖工業(yè)化利用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1大孔吸附樹脂無梗五加果:人工栽培無梗五加果實(shí)采于遼寧省內(nèi),自然干燥。大孔吸附樹脂河北滄州寶恩化工有限公司;考馬斯亮藍(lán)、苯酚、石油醚、無水乙醇、乙醚、丙酮、濃硫酸、鹽酸、三氯乙酸等均為分析純。1.2循環(huán)水試驗(yàn)儀器7200型可見分光光度計(jì)尤尼柯(上海)有限公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司;SHZ-III型循環(huán)水真空泵上海華琦科學(xué)儀器有限公司;BSZ-100型自動(dòng)部分收集器上海滬西分析儀器廠;TDL-5000B型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;HZQ-F型全溫振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;分析天平沈陽龍騰電子稱量儀器公司。1.3方法1.3.1無水乙醇+丙酮法將無梗五加干果粉碎,80℃水提,抽濾得到的濾液進(jìn)行一定體積的濃縮,4倍醇沉靜置過夜,5000r/min離心15min,將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,60℃烘干成粉末以備用。1.3.2脫蛋白質(zhì)脫皮法的比較1.3.2.粗多糖含量、蛋白含量及色素吸收劑用量的測定按氯仿:正丁醇體積比4:1配制Sevag試劑,將10mLSevag試劑與50mL質(zhì)量濃度一定的粗多糖樣液混合,劇烈振搖20min,4000r/min離心10min,分去下層有機(jī)相和中間的變性蛋白。收集上清液,將上述方法反復(fù)4次。測定多糖含量、蛋白含量及色素吸光度。計(jì)算蛋白去除率、脫色率和多糖損失率。1.3.2.上清液的制備取50mL粗多糖樣液,用10%三氯乙酸溶液調(diào)至pH3,混勻靜置過夜,4000r/min離心10min,棄去沉淀,收集上清液。測定多糖含量、蛋白含量及色素吸光度。計(jì)算蛋白去除率、脫色率和多糖損失率。1.3.2.多糖含量、蛋白含量及色素吸收劑用量取50mL粗多糖樣液,用2mol/L鹽酸調(diào)pH3,靜置過夜,4000r/min離心10min,棄去沉淀,收集上清液。測定多糖含量、蛋白含量及色素吸光度。計(jì)算蛋白去除率、脫色率和多糖損失率。1.3.2.活性物質(zhì)的提取取20mL粗多糖樣液,加入1.0g活性炭粉末,混勻50℃水浴2h,4000r/min離心10min,去除活性炭殘?jiān)?收集上清液。測定多糖含量、蛋白含量及色素吸光度。計(jì)算蛋白去除率、脫色率和多糖損失率。1.3.2.控制搖床條件取20mL粗多糖樣液,加入1.0g處理后的D101樹脂,控制搖床條件為溫度30℃、轉(zhuǎn)速140r/min、振搖6h,進(jìn)行吸附解吸。測定吸附液和解吸液中多糖、蛋白的含量,計(jì)算蛋白去除率、脫色率和多糖損失率。1.3.3樹脂水浸液及聚酰胺樹脂制備稱取一定量的HPD-600、AB-8、D101、D941、DM18、D280及聚酰胺樹脂,用水先洗去細(xì)小樹脂和碎樹脂,然后用乙醇浸泡4h,過濾放出浸液,繼續(xù)用乙醇洗滌,直到加水后不再渾濁。再用蒸餾水洗滌至無醇味,用蒸餾水浸泡備用。1.3.4樹脂對多糖、蛋白及色素的等溫吸附分別準(zhǔn)確稱取各種樹脂1.0g,置于100mL錐形瓶中。向其加入20mL質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的無梗五加果粗多糖溶液,用玻璃紙封口。搖床振搖6h,溫度控制在30℃,轉(zhuǎn)速140r/min,使樹脂吸附溶液成分,過濾,測定濾液中多糖,蛋白及色素的含量,計(jì)算樹脂對多糖、蛋白及色素的吸附率;將過濾后的樹脂置于100mL錐形瓶中,加入20mL蒸餾水洗脫,用玻璃紙封口后,搖床振搖6h,溫度控制在30℃,轉(zhuǎn)速140r/min,過濾,測定濾液中多糖、蛋白及色素含量,計(jì)算多糖、蛋白、色素的解吸率。在吸附率和解吸率基礎(chǔ)上,計(jì)算蛋白去除率、脫色率及多糖損失率。1.3.5多糖等基礎(chǔ)組合的收集取定量樹脂HPD-600和聚酰胺濕法裝柱,上樣液流速為1mL/min,用自動(dòng)部分收集器收集,每6mL一管,收集100管(6.6BV,即6.6個(gè)柱床體積),考查多糖、蛋白、色素的吸附情況,計(jì)算其吸附率;再用一定量的蒸餾水洗脫,同樣方法收集36管洗脫液(即2.4BV)?？疾於嗵呛偷鞍?、色素的解吸情況,計(jì)算解吸率。1.3.6多糖、蛋白及色素的含量測定取定量樹脂HPD-600和聚酰胺濕法裝柱,上樣量和洗脫體積都相同,并集吸附流出液和解吸液,測定合并后純化液中多糖、蛋白及色素的含量,計(jì)算蛋白去除率、多糖損失率和脫色率;將純化液濃縮烘干至粉末,測定粉末中多糖和蛋白的含量,比較HPD-600、聚酰胺純化后的多糖、蛋白的含量。1.3.7相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算1.3.8相關(guān)指標(biāo)的測定1.3.8.苯酚分光光度法準(zhǔn)確稱取25mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖粉末定容至250mL,制得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1mg/mL。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別取葡萄糖溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8mL至試管中,分別加水至1.0mL,然后依次加入5%苯酚1.6mL及7mL濃硫酸,搖勻靜置,25℃放置20min后在490nm處測吸光度,以1.0mL蒸餾水按同樣顯色操作作為空白。樣品中多糖含量測定:吸取適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度樣品液1.0mL,按上述步驟操作,于490nm波長處測吸光度。多糖測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=7.5679X-0.0023。式中:Y為吸光度,X為多糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)。1.3.8.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100.00mg加入95%乙醇50mL,再加入85%磷酸100mL,最后用蒸餾水定容至1000mL,置于棕色瓶中備用。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于試管,補(bǔ)水至1.0mL,加考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5mL,立即混勻,于595nm波長處測吸光度。樣品中蛋白含量的測定:取適當(dāng)質(zhì)量濃度的樣品溶液1mL,以空白試劑為參比,按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定法,分別測定其吸光度,計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。蛋白測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.687X+0.0168。式中:Y為吸光度,X為蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL)。2結(jié)果與分析2.1蛋白脫色及多糖去除率樹脂法是一種新型的多糖純化方法,操作簡便省時(shí),由表1可以看出,與傳統(tǒng)脫蛋白脫色方法相比,經(jīng)樹脂法純化后,蛋白和色素去除率分別達(dá)到70.8%和80.7%,而多糖損失率僅為20.1%,而活性炭法雖具有較高的蛋白和色素去除率,但多糖損失較多,達(dá)55.9%。因此選擇樹脂法進(jìn)一步開展研究。2.2不同樹脂對多糖的洗脫和多糖價(jià)值的比較由于樹脂極性、孔徑、比表面積不同,因此對有效成分吸附作用的強(qiáng)弱不同,解吸難易不同。本實(shí)驗(yàn)各種樹脂對無梗五加果多糖、蛋白及色素的吸附效果如圖1所示。由圖1可知,本實(shí)驗(yàn)所考察的7種樹脂對蛋白和色素的吸附率均大于對多糖的吸附率,因此,可通過收集吸附后的流出液獲得純化后的多糖溶液。但考慮到各樹脂對多糖的吸附率都在40%以上,均造成不同程度的多糖損失,如果不對樹脂柱洗脫,則多糖損失率較高。因此對各樹脂對多糖的洗脫情況進(jìn)一步進(jìn)行考察,各種樹脂解吸效果如圖2所示。由圖2可以看出,多糖的解吸率均比蛋白和色素的解吸率高。DM-18、AB-8、HPD-600和聚酰胺4種樹脂對多糖的解吸率較高,但伴隨多糖的解吸,蛋白和色素也會(huì)被部分洗脫下來。為更清晰比較各樹脂的純化效果,收集各樹脂吸附后的流出液和解吸液作為純化后的溶液,進(jìn)一步計(jì)算了經(jīng)各樹脂純化后的蛋白去除率、脫色率和多糖損失率,結(jié)果見表2。綜合比較蛋白去除率和脫色率及多糖損失率,可以看出AB-8、HPD-600和聚酰胺3種樹脂效果較好,蛋白去除率均達(dá)到80%以上,脫色率均達(dá)到75%以上,但AB-8與HPD-600、聚酰胺相比,多糖損失率稍高,因此選取HPD-600和聚酰胺兩種樹脂進(jìn)行后續(xù)純化試驗(yàn)。2.3蛋白和色素的吸附從圖3可以看出,相比HPD-600,聚酰胺對蛋白和色素的吸附力更強(qiáng),脫蛋白脫色效果更好,但同時(shí)對多糖的吸附也更強(qiáng),造成多糖損失嚴(yán)重,而HPD-600對多糖吸附相對較小,多糖損失率低。2.4不同洗脫體積的解吸率從圖4可以看出,兩樹脂對多糖的解吸率均遠(yuǎn)大于對蛋白的解吸率,當(dāng)洗脫體積達(dá)到一定量后,對多糖的解吸率也大于色素的解吸率。而HPD-600相比聚酰胺來說,對多糖的解吸率更高,表明多糖的損失率更低。2.5不同純化前后多糖溶液蛋白去除率及多糖成分含量的變化在吸附、解吸實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,收集兩樹脂的吸附流出液和解吸液合并作為純化后的多糖溶液,比較純化前后多糖溶液蛋白去除率、脫色率和多糖損失率,以及純化后多糖粉末中多糖含量和蛋白含量見表3。從表3可以看出,聚酰胺的蛋白去除率和脫色率比HPD-600的值高,但多糖損失率也要比HPD-600高,而多糖純