膠紅酵母蝦青素純品提取工藝的優(yōu)化

膠紅酵母蝦青素純品提取工藝的優(yōu)化

蝦青素是自然界普遍存在的天然胡蘿卜。它具有抗逆性、抗衰老、腫瘤、抗炎、提理酶、五彩繽紛、促進(jìn)生長等多種功能，以及糖尿病、心血管和神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療。目前,天然蝦青素的來源主要從水產(chǎn)品廢棄物、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母中提取1材料和方法1.1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定膠紅酵母ZTHY2,由本校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定,現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號CCTCCNO:M2015296)。1.2葡萄糖、2%nacl、ph值紅酵母種子培養(yǎng)基2%蛋白胨、1%酵母膏、2%葡萄糖、2%NaCl、pH值自然。紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基2%蛋白胨、2%酵母膏、1%牛肉膏、2%葡萄糖、2%NaCl、0.025%MnSO1.3膠紅酵母發(fā)酵液培養(yǎng)將膠紅酵母ZTHY2斜面保存菌種接種于紅酵母種子培養(yǎng)基,30℃、140rpm振蕩培養(yǎng)48h,即為膠紅酵母種子液;將種子液按5%接種于紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃、140rpm振蕩培養(yǎng)72h,即為膠紅酵母發(fā)酵液;將發(fā)酵液于4000rpm離心20min,棄上清液,用滅菌蒸餾水洗滌兩次,將沉淀細(xì)胞于50℃溫箱中烘干至恒重,即為干菌體細(xì)胞。1.4提取速尿清素的方法1.4.1rpm離心浸提液制備稱取0.1g干菌體細(xì)胞于離心管中,加入3mol/L鹽酸5mL,混勻,室溫靜置40min,沸水浴3min,迅速冷卻,4000rpm離心10min,棄上清液,蒸餾水洗滌2次,加入7mL浸提液,于50℃水浴中提取30min,4000rpm離心15min,重復(fù)提取2次;將上清液置于20mL刻度管中,分別用丙酮溶液、乙酸乙酯+乙醇(2∶1)溶液和乙腈+甲醇(7.5∶2.5)溶液作浸提液,作浸提處理后定容至15mL,即為蝦青素粗提液,待測。1.4.2超聲波裂解法參照文獻(xiàn)[11]中的方法,進(jìn)行了改進(jìn)。稱取0.1g干菌體細(xì)胞于離心管中,加入蒸餾水2mL,混勻,反復(fù)凍融(-30℃凍存,37℃溶解)3次,再用超聲波進(jìn)行裂解(超聲波的頻率40kHz,處理時(shí)間為10min,溫度為室溫),在裂解液中加入乙酸乙酯7mL,在50℃水浴中提取3h,4000rpm離心15min,重復(fù)提取2次;將上清液置于20mL刻度管中,用乙酸乙酯定容至15mL,即為蝦青素粗提液,待測。1.4.3無水乙醇提取稱取0.1g干菌體細(xì)胞于離心管中,加入5mL已預(yù)熱50℃的DMSO,混勻,置于50℃水浴鍋中5min,取出離心管并加入2mL無水乙醇,閉光靜置提取15min,4000rpm離心15min,重復(fù)提取2次;將上清液置于20mL刻度管中,用無水乙醇定容至15mL,即為蝦青素粗提液,待測。1.5溶液中蝦青素含量的測定用紫外可見分光光度計(jì)對蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品及蝦青素粗體液進(jìn)行掃描,確定476nm為最大吸收波長,直接用吸光值(A1.6蝦青素濃縮液的制備在避光條件下,將蝦青素粗提液15mL用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(溫度為35℃,真空度為0.08MPa)濃縮至5mL,即為蝦青素濃縮液。1.6.1koh的薄層層析分析取5mL蝦青素濃縮液,置于離心管中,加入10g/LKOH的甲醇溶液3mL,于4℃黑暗條件下靜置7h,10000rpm、4℃離心15min,收集上清液,即為皂化后的蝦青素提取液,進(jìn)行薄層層析鑒定。1.6.2koh的甲醇溶液制備取2.5mL蝦青素濃縮液,置于刻度試管中,加入10g/LKOH的甲醇溶液2.5mL,于20℃黑暗條件下振蕩60min;皂化后的溶液用甲醇定容至10mL,用0.45μm微孔濾膜過濾,濾液即為皂化后的蝦青素提取液,進(jìn)行薄層層析鑒定。1.6.3koh的乙醇溶液取5mL蝦青素濃縮液,置于分液漏斗中,加入乙酸乙酯5mL和20g/LKOH的乙醇溶液10mL,于40℃暗處靜置30min,加入飽和NaCl溶液直至液體出現(xiàn)分相,再于4℃冰箱中靜置3h,收集上層有色的乙酸乙酯相,即為皂化后的蝦青素提取液,進(jìn)行薄層層析鑒定。1.7確定最適合的展開劑薄層層析所使用的展開劑分別是:正己烷+二氯甲烷+丙酮(5∶2∶2)溶液、正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7∶2∶1)溶液、正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7∶1∶2)溶液、正己烷+丙酮(7∶3)溶液、正己烷+丙酮(5∶2)溶液、石油醚+丙酮(2∶1)溶液和甲醇+乙腈(3∶1)溶液等七種組合展開劑。根據(jù)比移值、分離度和分離個(gè)數(shù)進(jìn)行比較,從而選出最適合的展開劑。計(jì)算公式:比移值=b/a;分離度=2d/(W1+W2);式中,a:原點(diǎn)到展開劑前沿的距離(cm);b:原點(diǎn)到各類斑點(diǎn)中心的距離(cm);d:相鄰兩斑點(diǎn)中心的距離差;W1.8充填層析柱的填充用濕法裝柱,以正己烷為裝柱溶劑,將硅膠(200~300目)裝填到配有玻璃活塞的層析柱中。將皂化后的蝦青素提取液滴加于層析柱硅膠表面,用薄層層析選擇出的最佳展開劑為洗脫劑,收集不同的洗脫組分。1.9色譜條件及色譜圖用蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將柱層析獲得的洗脫組分用高效液相色譜(HPLC)測定蝦青素的含量。HPLC條件:Novapac18反向色譜柱(3.9mm×150mm,4μm),進(jìn)樣量為10μL,流動相為:A液,甲醇-四氫呋喃-乙腈(53∶36∶11);B液,水。梯度洗脫條件:0~40min,A液比例為65%~100%;40~45min,A液比例為100%~65%;45~48min,A液比例為65%;流速為1.0mL/min,柱溫為35℃,檢測波長為475nm。2結(jié)果與分析2.1酸熱法提取蝦青素的最適提取溶液膠紅酵母蝦青素提取方法的比較結(jié)果見表1。由表1可知,用乙酸乙酯+乙醇(2∶1)溶液作為浸提液的酸熱法提取的蝦青素的吸光值最高,明顯優(yōu)于其他四種提取方法。酸-熱法破壁不僅僅成本低、速度快、簡便易操作,而且其對海洋紅酵母細(xì)胞壁的破碎也最為徹底2.2皂化法分離蝦青素用3種方法對蝦青素濃縮液進(jìn)行皂化,獲取游離蝦青素,通過薄層層析跑點(diǎn)反映皂化的優(yōu)劣程度。展開劑為正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7∶1∶2)溶液時(shí),蝦青素濃縮液的薄層層析圖及等比例模式圖見圖1。理想的比移值應(yīng)該在0.2~0.8之間,由圖1可知,比移值在0.321位置上,水解液的點(diǎn)明顯加深、加大,為游離蝦青素的跑點(diǎn);而比移值在0.769位置上,水解液的點(diǎn)明顯變淺、變小,且此點(diǎn)已接近比移值的最大值,判定此點(diǎn)為蝦青素酯的跑點(diǎn)。3種皂化方法比較,KOH+乙醇法所得到的游離蝦青素最多,跑點(diǎn)最為明顯,分離度也最高。由于天然蝦青素多以酯類的形式存在,而酯化形式的蝦青素生物利用度較低,純化和檢測都較困難,故從膠紅酵母中提取蝦青素需要將粗提物中的蝦青素酯皂化水解成游離蝦青素。本試驗(yàn)用20g/LKOH的乙醇溶液作為蝦青素酯皂化液,在40℃下皂化30min,得出的樣品進(jìn)行薄層層析鑒定相比于其它方法更優(yōu),經(jīng)高效液相色譜檢測的皂化得到的游離蝦青素比率為35%。堿的濃度、皂化溫度、皂化時(shí)間均對皂化效果有著顯著的影響,Chen等2.3分離度的比較見表1薄層層析所用展開劑組合、展開時(shí)間、比移值及分離度的結(jié)果見表2。由表2可知,正己烷+石油醚+乙酸乙酯(7∶2∶1)溶液與正己烷+丙酮(5∶2)溶液的分離度較大,而正己烷+丙酮溶液的比移值適中,展開時(shí)間也較為理想。本試驗(yàn)選用了正己烷、丙酮、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙腈等成分組成的7組混合液作為薄層層析的展開劑,表明正己烷和丙酮(5∶2)混合液作為展開劑時(shí)的分離效果最好,層析板上分離出清晰的4個(gè)點(diǎn)。這與孫偉紅等2.4蝦青素提取的hplc分析蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由圖2可知,蝦青素在1~6μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,一次回歸方程為y=3.182x+0.748,相關(guān)系數(shù)R蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品及蝦青素提取液的洗脫組分的HPLC圖譜見圖3和圖4。由圖3和圖4可知,蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品和蝦青素提取樣品在本試驗(yàn)條件下的保留時(shí)間均為12.013min,但提取樣品在蝦青素的峰值之后出現(xiàn)了兩個(gè)極小的峰,可推測為蝦青素單酯及蝦青素雙酯;通過HPLC測定出的峰面積結(jié)合蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線一次性回歸方程可得出蝦青素提取樣品中的游離蝦青素濃度為96.8%。3蝦青素的提取純化本文通