m法測定植物源性菌的抗菌活性

m法測定植物源性菌的抗菌活性

二羥色胺抗劑（dhfr）可以選擇性地與dhfr結(jié)合，阻止或抑制正常的基質(zhì)結(jié)合，阻礙身體細(xì)胞的生長和繁殖所需的物質(zhì)——糖的正常代謝，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡并達(dá)到治療腫瘤的目的。1材料和機(jī)器1.1培養(yǎng)基和試劑12種培美曲塞衍生物(A1~A12,山東省藥學(xué)科學(xué)院);胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA),胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB),沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA),沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB,青島海博生物);0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè));溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT,Biosharp公司);DMSO(分析純,國藥集團(tuán));青鏈霉素混合液(100×,Solarbio公司);培美曲塞二鈉(PMX,天津德太然生物醫(yī)藥)。1.2fsafe-400te生物安全柜Spx-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅);HFsafe-1500TE生物安全柜(上海力申);SpectraMaxI3多功能酶標(biāo)儀(美國MD公司);JW-1032常溫低速離心機(jī)(安徽嘉文)。1.3菌種和培養(yǎng)基大腸桿菌(8099),金黃色葡萄球菌(ATCC6538),白色念珠菌(ATCC10231),由山東省實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)室提供。2方法2.1懸浮液的制備將保存于-80℃的甘油凍存菌種采用平板劃線法接種于相應(yīng)培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)(各菌株所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件2.2適用于測定抗菌活性的mtt方法的建立2.2.1最適檢測波長的確定將菌懸液用0.9%氯化鈉注射液按1:2、1:4比例稀釋后,取原液和稀釋菌液加入96孔板,每孔100μl,之后加入20μlMTT溶液,將菌株置于恒溫培養(yǎng)箱(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為37℃,白色念珠菌為28℃)中培養(yǎng)60min后,1000r/min離心10min,小心吸去上清,各加入0,100,150μlDMSO溶解MTT溶液與細(xì)菌形成的甲臜結(jié)晶,震蕩5min,用酶標(biāo)儀測定其在400~700nm范圍內(nèi)每隔50nm的光密度值(OD),以O(shè)D值最大時的檢測波長作為最適檢測波長。同時設(shè)置空白孔及調(diào)零孔,各濃度至少3個平行。2.2.2最佳細(xì)菌濃度的確定取3種菌株處于對數(shù)生長期的菌懸液,用適量0.9%氯化鈉注射液稀釋至1×102.3綠色活性試驗(yàn)2.3.1mic測試?yán)媒⒌腗TT法測定抗菌活性,具體步驟如下:將培養(yǎng)好的菌液10倍系列稀釋至102.3.2測量的精度2.4評分as所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。結(jié)果用ue0af±s表示。采用Excel及SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及顯著性分析,采用Origin8.0軟件進(jìn)行MIC3結(jié)果3.1適用于測定抗菌活性的mtt方法3.1.1dmso用量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響MTT溶液與大腸桿菌形成的甲臜結(jié)晶經(jīng)DMSO溶解后,在450~600nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰,且不同濃度菌液的吸收峰均在500nm左右,而沒有用DMSO溶解的甲臜,其吸收峰在650nm左右;MTT與金黃色葡萄球菌形成的甲臜經(jīng)DMSO溶解后,在450~550nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰,且有明顯的特征性吸收峰,不同濃度菌液的吸收峰均在500nm左右,而沒有用DMSO溶解的甲臜,其吸收峰在600nm左右;MTT與白色念珠菌形成的甲臜經(jīng)DMSO溶解后,在400~550nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰,沒有明顯的特征性吸收峰。以上結(jié)果提示:是否使用DMSO對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響;不同用量的DMSO得到的吸收峰特征圖較為一致,且各OD值接近,說明使用100μl的DMSO能將甲臜充分溶解。同時,菌液濃度過高時,得到的OD值較大,線性關(guān)系不好且特征性吸收峰不明顯,因此,菌液的使用濃度不宜過高。3.1.2確定測量范圍不同濃度梯度菌液的OD3.2生物對大腸桿菌的抑制作用MTT法檢測結(jié)果表明,12種培美曲塞衍生物對大腸桿菌及白色念球菌均無抑制作用,化合物A4、A7、A11、A12對金黃色葡萄球菌有良好的抑制效果,MICMIC4細(xì)胞生長和活的測定四甲