白花蛇舌草的化學(xué)成分、藥理活性及生物活性

白花蛇舌草的化學(xué)成分、藥理活性及生物活性

白花蛇舌草具有清熱解毒、潤濕可口的功效。打破膽囊紊亂的發(fā)病機(jī)制，脾胃疾病（如濕熱黃疸和炎癥疾?。ㄈ鐫駸岣窝缀脱装Y）的治療得到了廣泛的應(yīng)用。白花蛇舌草主要含有環(huán)烯醚萜苷類（車葉草苷、京尼平苷酸、雞屎藤次苷等）、三萜類（熊果酸、齊墩果酸）、蒽醌類（2-甲基-3-羥基蒽醌、2-甲基-3-甲氧基蒽醌）、黃酮類（山柰酚、槲皮素）等化學(xué)成分。藥理研究1材料和機(jī)器1.1廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量（280±20)g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物在實驗室環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周（溫度：25℃，濕度：60%），正常飲食和喂水。1.2主要試劑和儀器白花蛇舌草（批號：20110907）購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林穎副教授鑒定為茜草科耳草屬白花蛇舌草（HerbaHedyotidisDiffusae,HHD）正品；α-萘異硫氰酸酯（ANIT，批號：STBC5577V）、熊去氧膽酸（UDCA，批號：20120621），阿拉丁試劑公司；總膽汁酸（TBA，批號：120321）、總膽紅素試劑盒（TBIL，批號：120428）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（ALT，批號：20120342）、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（AST，批號：20120422）、堿性磷酸酶試劑盒（ALP，批號：20120822）、谷胱甘肽試劑盒（GSH，批號：20120615）和超氧化物歧化酶試劑盒（SOD，批號：20120645），南京建成生物工程研究所；PE10導(dǎo)管，英國SmithMedical公司；總RNA提取試劑盒（批號：120805），寶生物工程（大連）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：20130731）、TaqMan1.3儀器、檢測方法PowerPacHC電泳儀、GC-800光密度掃描儀，美國BioRad公司；DDY-lll型水浴式電轉(zhuǎn)印槽，北京六一儀器廠；StepOnePlusReal-time實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；BDU-700核酸蛋白分析儀，美國Beckman公司；KDC-120HR高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科技儀器有限公司；BT3000全自動生化分析儀，意大利愛康公司；M1000FLUORplus多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；TP1020生物組織自動脫水機(jī)、EG1140石蠟包埋機(jī)）、RM2235全自動輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)、LeicaTP1020型全自動脫水機(jī)，德國萊卡公司；OlympusBX-51型病理圖像采集系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司。1.4乙醇的提取精密稱取2kg白花蛇舌草，剪碎，加10倍量的80%乙醇浸泡過夜，回流提取2次（10倍量，每次2h），合并回流液，過濾，減壓回收乙醇，濃縮至密度為1.05g·mL1.5白花蛇舌草醇提物對熊去氧膽酸的影響48只SD大鼠隨機(jī)分為6組（每組8只）：分別為正常對照組，模型組，白花蛇舌草醇提物（HHD）低、中、高劑量組，熊去氧膽酸（UDCA）組。HHD低、中、高劑量組和UDCA組分別灌胃HHD(0.25、0.5和1g·kg1.6膽汁流量測經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦（1.0g·kg1.7上清液的制備腹主動脈采血，在室溫下以3000×g離心10min，取上清液。采用全自動生化分析儀測定血清中ALT、AST、ALP、TBA和TBIL的含量；采用酶標(biāo)儀微量酶標(biāo)法測定肝臟中GSH和SOD的含量。1.8肝臟病理社會學(xué)的觀察1.10統(tǒng)計處理方法各指標(biāo)測定結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差2結(jié)果2.1各組大鼠肝臟功能指標(biāo)比較結(jié)果見圖1。與正常對照組比較，模型組大鼠血清中肝功能酶學(xué)指標(biāo)（ALT、AST和ALP）和黃疸指標(biāo)（TBIL和TBA）均明顯升高，而肝臟組織抗氧化因子水平（GSH和SOD）則顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠造模成功。與模型組比較，各給藥組肝功能酶學(xué)指標(biāo)（ALT、AST和ALP）和黃疸指標(biāo)（TBIL和TBA）均顯著降低，肝臟組織抗氧化因子（GSH和SOD）的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05,P<0.01）。結(jié)果表明，白花蛇舌草可以顯著改善ANIT誘導(dǎo)的急性膽汁淤積性肝損傷作用。2.2各組大鼠肝內(nèi)膽汁酸精神損害情況比較結(jié)果見圖2。與正常對照組比較，模型組大鼠膽管膽汁流量和膽汁成分（TBIL和TBA）排泄均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積模型大鼠肝內(nèi)膽汁酸排泄障礙。與模型組比較，各給藥組膽汁流量明顯增加，膽汁成分TBIL和TBA排泄明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05,P<0.01）。結(jié)果表明，白花蛇舌草可以顯著提高ANIT誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠的膽汁流量。2.3各組大鼠肝臟功能及肝心功能組織病理學(xué)比較結(jié)果見圖3。正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列呈索狀，肝細(xì)胞無變性壞死；匯管區(qū)無纖維組織增生；無炎細(xì)胞浸潤；血管及膽管結(jié)構(gòu)正常。與正常對照組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞輕度脂肪變性，較多肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪空泡形成；中央靜脈周圍和匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤；膽管上皮明顯增生。與模型組比較，白花蛇舌草低劑量組大鼠仍可見較多肝細(xì)胞脂肪變性，中央靜脈周圍及匯管區(qū)可見淋巴細(xì)胞浸潤，較多膽管上皮增生；而中、高劑量以及UDCA組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，僅見個別肝細(xì)胞脂肪變性，匯管區(qū)見少量淋巴細(xì)胞浸潤，膽管上皮未見明顯增生。結(jié)果表明白花蛇舌草具有抗ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷的作用。2.4mrna的表達(dá)水平結(jié)果見圖4。與正常對照組比較，模型組肝內(nèi)主要膽汁酸核受體（FXR和SHP）、膽汁酸頂腔側(cè)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（BESP、MRP2和MDR2）、膽汁酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體（NTCP、OATP1A1和OATP1A2）以及膽汁酸合成酶（CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1）的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而膽汁酸基底側(cè)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（OSTα、OSTβ、MRP3和MRP4）則顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，白花蛇舌草組膽汁酸核受體FXR和SHP的表達(dá)顯著升高，導(dǎo)致膽汁酸頂腔側(cè)膜（BESP、MRP2和MDR2）和基底側(cè)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（OSTα、OSTβ、MRP3和MRP4）明顯提高（P<0.05,P<0.01）；同時，顯著降低膽汁酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體（NTCP和OATP1A1）以及膽汁酸合成酶（CYP7A1）的mRNA表達(dá)水平（P<0.05,P<0.01）。結(jié)果表明，白花蛇舌草可以上調(diào)膽汁酸核受體FXR-SHP軸的表達(dá)水平，以提高ANIT誘導(dǎo)的膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)基因和進(jìn)一步抑制膽汁酸合成酶的表達(dá)。3肝內(nèi)急性汁液積極開展及相關(guān)指標(biāo)檢測，見表1。在anit配制前后肝組織中表達(dá)降低肝臟功能膽汁淤積，也稱膽汁淤積綜合征，主要由肝內(nèi)-肝外系統(tǒng)膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及重吸收障礙引起肝臟及體循環(huán)膽汁酸腸肝循環(huán)受阻，而致膽汁酸、膽紅素等膽汁成分過度堆積于肝造成的膽汁淤積屬中醫(yī)“黃疸”范疇，“疸”乃火熱之意，火熱之邪熏蒸肝膽而致肝失疏泄，導(dǎo)致瘀血內(nèi)阻，與火熱之邪交結(jié)，瘀熱阻滯，膽汁不循常道而發(fā)黃?！稄埵厢t(yī)通》云：“以諸黃雖多濕熱，然經(jīng)脈久病，不無瘀血阻滯也”，而且“瘀久化熱”。這種血瘀重、里熱盛的特點，正是淤膽型肝炎黃疸日漸加深或持久不退的主要原因。因此，中醫(yī)常用清熱利濕法治療膽汁淤積，且臨床療效顯著本研究結(jié)果表明，在灌服ANIT48h后，大鼠的膽汁流量和膽汁成分（TBA、TBIL）分泌量明顯減少，而血清中TBA和TBIL水平上升顯著；同時血清中ALT、AST和ALP含量明顯升高；HE染色結(jié)果亦提示肝細(xì)胞脂肪變性、脂肪空泡、壞死明顯。以上結(jié)果均證明了肝內(nèi)急性膽汁淤積模型誘導(dǎo)成功，與文獻(xiàn)報道膽汁正常分泌有賴于肝基底側(cè)膜（竇膜）和頂腔側(cè)膜（毛細(xì)膽管膜）上各種合成、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能正常與否與研究大鼠肝臟用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4～5μm切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色。具體步驟：二甲苯脫蠟5min；無水乙醇洗脫二甲苯2次，每次1min;95%→90%→85%酒精洗脫各1min；蒸餾水浸洗1min；蘇木素染色5min，水洗5min;1%鹽酸酒精分化30s；水洗5min；伊紅溶液染色1min，水沖洗5min；常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化，并采用OlympusBX-51型病理圖像采集系統(tǒng)分析圖片。肝組織壞死程度按Rudich等取大約100mg肝臟組織進(jìn)行勻漿，采用Trizol試劑提取、純化肝臟組織總mRNA，并測定其濃度及純度。采用大連寶成TAKARA公司的cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用StepOnePlusReal-ti