基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件

第二章基因工程與食品產(chǎn)業(yè)

第一節(jié)基因工程概述第二節(jié)工具酶與基因載體第三節(jié)基因工程的基本技術(shù)第四節(jié)基因工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用第二章基因工程與食品產(chǎn)業(yè)第一節(jié)基因工程概述第二節(jié)1第一節(jié)基因工程概述一、基因工程的概念與主要內(nèi)容二、基因工程的發(fā)展概況第一節(jié)基因工程概述一、基因工程的概念與主要內(nèi)容二、基因工2核酸核糖核酸（RNA）脫氧核糖核酸（DNA）核糖體RNA（rRNA）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）信使RNA（mRNA）分類分布細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、質(zhì)粒等功能遺傳信息的載體細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核核糖體的成分轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸傳遞DNA的遺傳信息，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成核酸核糖核酸脫氧核糖核酸（DNA）核糖體RNA（rRNA）轉(zhuǎn)3元素組成:C、H、O、N、P（9%～10%）分子組成—三部分堿基(base)：嘌呤堿，嘧啶堿戊糖(ribose)：核糖，脫氧核糖磷酸(phosphate)二、核酸的化學(xué)組成構(gòu)成核酸的基本單位為核苷酸元素組成:分子組成—三部分堿基(base)：嘌呤堿，嘧啶堿二4核酸中的堿基分兩類：（1）嘧啶堿：胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）胸腺嘧啶（T）（2）嘌呤堿：腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）核酸中的堿基分兩類：（1）嘧啶堿：胞嘧啶（C）5…核苷…脫氧核苷堿基種類：核苷1ONNNH21′OHOCH2OHOH核糖…核苷堿基種類：核苷1ONNNH21′OHOCH2OHOH核6核苷酸(ribonucleotide)ONNNH2OCH2OHOHPOOOHOH核苷/脫氧核苷磷酸酯鍵核苷酸的結(jié)構(gòu)：磷酸核苷酸(ribonucleotide)ONNNH2OCH2O75′端3′端多個(gè)核苷酸3′,5′磷酸二酯鍵核酸AOCH2OHPOOO-O5'COCH2POOO-O3'5'TOCH2POOO--O3'5'多個(gè)核苷酸5′端3′端多個(gè)核苷酸3′,5′磷酸二酯鍵核酸AOCH2OH8基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件9復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。親代DNA復(fù)制子代DNA復(fù)制(replication)親代DNA復(fù)制子代DNA10參與DNA復(fù)制的物質(zhì)DNA復(fù)制系統(tǒng)底物dNTP聚合酶DNA-pol模板解成單鏈單鏈的DNA母鏈引物與模板互補(bǔ)的RNA片段其它酶和蛋白質(zhì)因子底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶簡(jiǎn)寫為DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合解螺旋酶引物酶單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA連接酶等參與DNA復(fù)制的物質(zhì)DNA復(fù)底物聚合酶模板引物其它酶底物(s11半保留復(fù)制：新DNA分子中的兩條鏈，一條來自親代DNA分子，另一條是新合成的半保留復(fù)制：12基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件13基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件14轉(zhuǎn)錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄RNADNA此過程把DNA的堿基序列轉(zhuǎn)抄成RNA。5′3′3′5′編碼鏈3′5′模板鏈轉(zhuǎn)錄(transcription)生物體以DNA為模板合成15一、基因工程的概念與主要內(nèi)容（一）基因工程的概念基因工程：運(yùn)用酶學(xué)方法，將外源基因與載體DNA在體外進(jìn)行重組，將形成的重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使外源基因在其中復(fù)制表達(dá)，從而改造生物特性，生產(chǎn)出人類所需要的產(chǎn)物的高新技術(shù)。。一、基因工程的概念與主要內(nèi)容（一）基因工程的概念基因工程16食品基因工程：利用基因工程的技術(shù)和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，以改良食品的品質(zhì)和性狀，提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、貯藏加工性狀以及感官性狀的技術(shù)。食品基因工程：17（二）

基因工程的主要內(nèi)容概括起來，基因工程的操作過程一般分4個(gè)步驟。

獲得目的基因；將目的基因與載體連接形成重組DNA；將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；篩選出能表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞（二）

基因工程的主要內(nèi)容概括起來，基因工程的操作過程一般18酶段子體酶段子體19

20二、

基因工程的發(fā)展概況

1972年，Berg等首次用限制性內(nèi)切酶EcoRI切割病毒SV40DNA和λ噬菌體DNA，經(jīng)過連接，組成重組DNA分子。

1973年，Cohen將傷寒沙門氏菌抗鏈霉素質(zhì)粒與大腸桿菌抗四環(huán)素質(zhì)粒在體外重組，獲得異源的重組質(zhì)粒DNA，并把重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，建立了抗四環(huán)素和抗鏈霉素的大腸桿菌克隆體.二、

基因工程的發(fā)展概況1972年，Berg等首次用21

PaulBerg(whosharedthe1980NobelPrizeinchemistryforthiswork).

PaulBerg(whosharedthe22

1972StanleyCohenandHerbertBoyerdiscoverrecombinantDNAtechnology,consideredtobethebirthofmodernbiotechnology

HerbertW.Boyer,Ph.D.

HerbertW.Boyer,Ph.D.

23第一例基因工程實(shí)驗(yàn)第一例基因工程實(shí)驗(yàn)241972年美國(guó)加州大學(xué)的Boyer從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種能夠在特定位置上切割DNA分子的酶即限制性內(nèi)切酶

1972年美國(guó)加州大學(xué)的Boyer從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種能夠25

1986年美國(guó)和法國(guó)的科學(xué)家在世界上第一次進(jìn)行了抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草的田間實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，基因工程技術(shù)已走出實(shí)驗(yàn)室，基因工程技術(shù)的應(yīng)用已發(fā)展成為一個(gè)巨大的產(chǎn)業(yè)，基因工程在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域已顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值。1986年美國(guó)和法國(guó)的科學(xué)家在世界上第一次進(jìn)行了抗除草26

在農(nóng)業(yè)上，基因工程發(fā)展速度勢(shì)頭強(qiáng)勁。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積由1996年的170萬hm2，增加到4

420萬hm2，增加了25倍之多。2000年美國(guó)、加拿大、阿根廷、中國(guó)4個(gè)國(guó)家轉(zhuǎn)基因作物的種植面積占全球種植面積的99.9％。全世界轉(zhuǎn)基因作物按種植面積排序分別為大豆、玉米、棉花、油菜籽。在農(nóng)業(yè)上，基因工程發(fā)展速度勢(shì)頭強(qiáng)勁。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000年全27

我國(guó)的農(nóng)業(yè)基因工程研究于20世紀(jì)80年代初期開始啟動(dòng)，并于20世紀(jì)80年代中期開始將生物技術(shù)列入國(guó)家“863‘’高科技發(fā)展計(jì)劃。我國(guó)正在研究的轉(zhuǎn)基因植物種類達(dá)47種以上，涉及各類基因103個(gè)以上。目前我國(guó)被批準(zhǔn)進(jìn)行商品化生產(chǎn)的6種轉(zhuǎn)基因植物：轉(zhuǎn)基因耐貯藏的番茄、轉(zhuǎn)查爾酮合成酶基因矮牽牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗蟲棉花和保齡棉等。

我國(guó)的農(nóng)業(yè)基因工程研究于20世紀(jì)80年代初期開始啟動(dòng)，并于28第二節(jié)酶和基因載體

基因工程的操作，是依賴于一些重要的酶(如限制性內(nèi)切酶、核酸酶、連接酶、聚合酶等)作為工具來對(duì)基因進(jìn)行切割和拼接等操作，這些酶被稱為工具酶(enzymeoftools)。到目前為止，常用的工具酶有300多種。第二節(jié)酶和基因載體基因工程的操作，是29

基因工程載體(carrier):

在細(xì)胞內(nèi)具有自我復(fù)制能力的運(yùn)載目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的運(yùn)載體.基因工程載體(carrier):30一、基因工程的工具酶種類主要有：限制性內(nèi)切酶連接酶聚合酶核酸酶堿性磷酸酶逆轉(zhuǎn)錄酶等一、基因工程的工具酶種類主要有：31

能將聚核苷酸鏈的磷酸二酯鍵切斷的酶稱為核酸酶。核酸酶中傾向于將核酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵切斷的酶，稱為內(nèi)切核酸酶。

內(nèi)切核酸酶中能夠識(shí)別DNA分子上某些特定的堿基序列并且將其切開的那一類酶，稱為限制性內(nèi)切酶。而核酸酶中從聚核苷酸鏈一端切割磷酸二酯鍵的酶稱為外切核酸酶。能將聚核苷酸鏈的磷酸二酯鍵切斷的酶稱為核酸酶。32（一）

限制性內(nèi)切酶

在早期，要進(jìn)行DNA分子的重組，染色體DNA通過帶小孔的針頭或通過超聲波破碎為0.3～5

kb的碎片，這種方法只是隨機(jī)地切斷DNA，無法確切地得到目的基因。自從在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一種能夠在特定位置上切割DNA分子的酶以后，分子克隆才真正地得以發(fā)展。（一）

限制性內(nèi)切酶

在早期，要進(jìn)行DNA分子的重組，染色33

限制性內(nèi)切酶是基因工程中不可缺少的工具酶，有人稱之為“基因工程的手術(shù)刀”。限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)專一，它作用于DNA分子，產(chǎn)生特異的DNA片段。限制性內(nèi)切酶是基因工程中不可缺少的工具酶，有人稱之為“34

351、限制性內(nèi)切酶的分類

根據(jù)限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)和功能特性，分為三種類型。

I型限制性內(nèi)切酶：

是多聚體蛋白質(zhì)，具有切割DNA的功能，作用時(shí)需要ATP、Mg2+和S—腺苷蛋氨酸(SAM)的存在。

切割DNA的方式是：先與雙鏈DNA上未加修飾的識(shí)別序列相互作用，然后沿著DNA分子移動(dòng)，在行進(jìn)相當(dāng)于1

000～5

000個(gè)核苷酸的距離之后在隨機(jī)位置上切割單鏈DNA。由于這類酶不能專門切割DNA的某些特殊位點(diǎn)，所以未在基因工程操作中大量使用。

1、限制性內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)36Ⅱ型限制性內(nèi)切酶：

是一類分子量較小的單體蛋白，作用時(shí)僅需要Mg2+存在即可維持活性，它可在特殊位點(diǎn)切割DNA，產(chǎn)生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段.這類酶被廣泛地應(yīng)用于基因工程Ⅱ型限制性內(nèi)切酶：是一類分子量較小的單37

Ⅲ型限制性內(nèi)切酶：一些具有獨(dú)特的識(shí)別方式和切割方法的內(nèi)切酶，如MboⅡ，它識(shí)別GAAGA序列，然后在DNA的每一條鏈上識(shí)別序列的一側(cè)開始測(cè)量一定距離(如8或7個(gè)核苷酸)以后進(jìn)行切割，產(chǎn)生僅有一個(gè)堿基突出的3ˊ末端(N表示任意一個(gè)堿基)。

5ˊ—GAAGANNNNNNNN↓—3ˊ

3ˊ—CTTCTNNNNNNN↓—5ˊ

Ⅲ型限制性內(nèi)切酶：一些具有獨(dú)特的識(shí)別方式和切割方法的內(nèi)切酶38

I型限制性內(nèi)切酶、Ⅲ型限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)不固定，不能產(chǎn)生可以利用的DNA片段Ⅱ型限制性內(nèi)切酶具有可以控制和預(yù)測(cè)的位點(diǎn)特異性切割的性質(zhì)，并且產(chǎn)生固定的DNA片段?；蚬こ趟玫南拗菩詢?nèi)切酶都是Ⅱ型限制性內(nèi)切酶。I型限制性內(nèi)切酶、Ⅲ型限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)不固定，不能產(chǎn)生392、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的命名與作用特點(diǎn)

其命名原則是：

用具有某種限制性內(nèi)切酶的有機(jī)體學(xué)名縮寫來命名，即：有機(jī)體屬名的第一個(gè)字母(大寫，斜體)和種名的前兩個(gè)字母(小寫，斜體)構(gòu)成基本名稱；株系數(shù)字通常都省略，但如果酶是存在于一種特殊的菌株中，在基本名稱后面還應(yīng)該加上菌株的名稱符號(hào)；羅馬數(shù)字用來表示從同一個(gè)細(xì)菌中分離出來的不同的限制性內(nèi)切酶。2、Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的命名與作用特點(diǎn)其命名原則是：用40例如，EcoRI中的Eco表示從大腸桿菌(Escherichiacoli)中分離出來的，R代表大腸桿菌的R株，I表示從中分離出的第一種限制性內(nèi)切酶。從流感嗜血菌(Hacmophilusinflucnzac)中菌株d分離出來的3種限制酶，分別為Hind

I、HindⅡ、HindⅢ。

例如，EcoRI中的Eco表示從大腸桿菌(Escheric41

EcoRI是最早發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，是從大腸桿菌中分離鑒定出來的。EcoRI可特異地結(jié)合在一段6個(gè)核苷酸的DNA區(qū)域里，在每一條鏈的鳥嘌呤和腺嘌呤之間切斷DNA鏈。DNA鏈經(jīng)EcoRI對(duì)稱切割后會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)單鏈末端.

EcoRI是最早發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，是從大腸桿菌中分離42基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件43基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件44

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶是一種位點(diǎn)特異性酶，能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特異序列，并在特異部位上切斷DNA分子。限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)可以是4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、8個(gè)甚至更多的堿基對(duì)。這些DNA序列大多呈回文結(jié)構(gòu)，也就是說，序列被正讀和反讀是一樣的。

由于DNA具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，識(shí)別核苷酸序列只能從5ˊ末端向3ˊ末端讀其堿基序列，因此，在識(shí)別序列的兩條核苷酸鏈中堿基排列次序是完全相同的，這種結(jié)構(gòu)稱回文結(jié)構(gòu)。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶是一種位點(diǎn)特異性酶，能夠識(shí)別雙鏈DNA分子45基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件46限制性內(nèi)切酶的切割方式限制性內(nèi)切酶按其切割雙鏈DNA方式分為兩種：黏性末端和平整末端。黏性末端:限制性內(nèi)切酶錯(cuò)位切割DNA雙鏈而形成互補(bǔ)的單鏈末端?；螂p鏈DNA中沒有配對(duì)的堿基末端，被稱為黏性末端

限制性內(nèi)切酶的切割方式限制性內(nèi)切酶按其切割雙鏈DNA方式分47基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件48基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件49平齊末端:有些限制性內(nèi)切酶在同一位點(diǎn)平齊切割DNA兩條鏈，而形成兩端平整的DNA分子.平齊末端:有些限制性內(nèi)切酶在同一位點(diǎn)平齊切割DNA兩條鏈，而50基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件51cDNA是在逆轉(zhuǎn)錄酶催化作用下，在體外以mRNA為模板合成的互補(bǔ)DNA。

從真核生物中分離純化所有的mRNA，接著以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨之將cDNA與相關(guān)載體連接，使每一個(gè)cDNA分子都與一個(gè)載體分子連接成重組DNA。然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體就稱為cDNA文庫。cDNA文庫:指某種特定細(xì)胞及特定狀態(tài)下的全部cDNA克隆。cDNA是在逆轉(zhuǎn)錄酶催化作用下，在體外以mRNA為模板合成的522、

DNA連接酶

DNA連接酶:

能將兩段DNA拼接起來的酶該酶催化DNA相鄰的5ˊ磷酸基和3ˊ羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，將DNA單鏈缺口封合起來。大腸桿菌和動(dòng)植物細(xì)胞中都有DNA連接酶?；蚬こ讨谐Ｓ玫倪B接酶主要有：T4DNA連接酶和大腸桿菌連接酶，而以前者為最常用。2、

DNA連接酶

DNA連接酶:能將兩段DNA拼接53基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件54

T4DNA連接酶的相對(duì)分子質(zhì)量為68000的單個(gè)多肽鏈，是T4噬菌體感染大腸桿菌而產(chǎn)生的。在連接反應(yīng)中多以ATP為輔助因子。T4DNA連接酶的相對(duì)分子質(zhì)量為68000的單個(gè)多肽鏈，是553、DNA聚合酶

(DNApolymerase)

基因工程中常用的DNA聚合酶有：大腸桿菌聚合酶I(全酶)；大腸桿菌聚合酶I大片段(Klenow片段)；T4噬菌體DNA聚合酶；T7噬菌體聚合酶及經(jīng)修飾的T7噬菌體聚合酶(測(cè)序酶)；

在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程中起著重要的作用。它們通常被分為DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ三類。DNA聚合酶I是基因工程中最常用的工具酶。3、DNA聚合酶

(DNApolymerase)56耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)；末端轉(zhuǎn)移酶(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，也屬DNA聚合酶)；逆轉(zhuǎn)錄酶(依賴于RNA的DNA聚合酶)。耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)；57DNA連接酶與聚合酶的區(qū)別DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板。DNA連接酶與聚合酶的區(qū)別DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已58（1）

大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)

DNA聚合酶I的相對(duì)分子質(zhì)量為109000，是一條約1000個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。它具有三種活性：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性；3ˊ→5ˊ外切核酸酶活性；5ˊ→3‘外切核酸酶活性。

（1）

大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)

DNA聚合酶I的59基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件60核酸外切酶活性3→5外切酶活性能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。5→3外切酶活性能切除突變的DNA片段。

合成中的DNA分子核酸外切酶活性3→5外切酶活性5→3外切酶61(2）大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)

Klenow片段是用枯草桿菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I產(chǎn)生的，也可通過克隆技術(shù)而獲得。它的相對(duì)分子質(zhì)量是76000，為一條單多肽鏈。

具有5ˊ→3'聚合酶活性和3ˊ→5'外切酶活性，而無5ˊ→3'外切酶活性。(2）大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)

62Klenow片段的主要用途補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的3’凹端；用[32P]dNTP補(bǔ)平3’凹端，對(duì)DNA片段進(jìn)行末端標(biāo)記；對(duì)帶3’突出端DNA進(jìn)行末端標(biāo)記；cDNA克隆中，用于合成cDNA第二鏈；在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA；應(yīng)用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序。

Klenow片段的主要用途補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的363（3）T4噬菌體DNA聚合酶

相對(duì)分子質(zhì)量為114000具有5ˊ→3ˊ聚合酶活性及3ˊ→5ˊ外切核酸酶活性但其3ˊ→5ˊ外切酶活性對(duì)單鏈DNA的作用比對(duì)雙鏈DNA的作用更強(qiáng)，而且外切核酸酶活性比Klenow片段要強(qiáng)200倍。（3）T4噬菌體DNA聚合酶

相對(duì)分子質(zhì)量為11400064主要用途補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶切割DNA后產(chǎn)生的3’凹端；對(duì)帶有3’突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記；標(biāo)記用作探針的DNA片段；將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成為平端；使結(jié)合于單鏈DNA模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸主要用途補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶切割DNA后產(chǎn)生的3’凹端；65（4）T7噬菌體DNA聚合酶及其改造的測(cè)序酶

該酶是所有已知DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一個(gè)，它所催化合成的DNA的平均長(zhǎng)度要比其他DNA聚合酶催化合成的DNA平均長(zhǎng)度大得多。它的3ˊ→5ˊ外切核酸酶活性約為Klenow片段的1000倍，但它沒有5ˊ→3ˊ外切核酸酶活性。

主要用途：用于拷貝長(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng)；通過補(bǔ)平或交換(置換)反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記。

（4）T7噬菌體DNA聚合酶及其改造的測(cè)序酶

該66（5）

耐熱DNA聚合酶(TaqDNA)

相對(duì)分子質(zhì)量為65000是一種耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶。具有5’→3’外切核酸酶活性主要用途：DNA測(cè)序；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增

。（5）

耐熱DNA聚合酶(TaqDNA)

相對(duì)分子質(zhì)量67（6）

末端轉(zhuǎn)移酶

催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3′-OH末端上催化作用不要求有模板，但需有Co2+的存在。末端轉(zhuǎn)移酶可給一些DNA分子的3′-OH末端接上寡dA或dG；另一些DNA分子的3′-OH末端接上寡dT或dC，混合這些分子，即可使同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。主要用途：給載體或cDNA加上互補(bǔ)的同聚尾；DNA片段3′末端的放射同位素標(biāo)記。（6）

末端轉(zhuǎn)移酶

催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3684.堿性磷酸酯酶

堿性磷酸酯酶：是催化從單鏈或雙鏈DNA和RNA分子中除去5′磷酸基，即脫磷酸作用。

在基因工程中得到廣泛使用的有兩種：一種是BAP：從大腸桿菌中提取的另一種是CIP：從牛小腸提取的。兩種酶反應(yīng)均需要Zn2+。由于BAP耐熱，而CIP在70℃加熱10分鐘或經(jīng)酚抽提則失活；CIP的特異活性較BAP高10-20倍，因此，CIP應(yīng)用更廣泛。4.堿性磷酸酯酶

堿性磷酸酯酶：是催化從單鏈或雙鏈DNA69主要用途：去除DNA和RNA的5′磷酸基，產(chǎn)生5′羥基末端，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用[α-32P]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記，繼而進(jìn)行序列分析；去除載體DNA兩末端的5′磷酸基，防止載體DNA自我環(huán)化，提高DNA重組率。主要用途：去除DNA和RNA的5′磷酸基，產(chǎn)生5′羥基末端，705.S1核酸酶是一種特異性單鏈核苷酸外切酶，能降解單鏈DNA和單鏈RNA，不能降解其雙鏈DNA或RNA的雜合子。

5.S1核酸酶是一種特異性單鏈核苷酸外切酶，能降解單鏈DN71主要用途：去除DNA片段的單鏈突出端，使之成為平端；去除cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；進(jìn)行S1核酸酶保護(hù)試驗(yàn)，分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；成熟mRNA與基因組DNA雜交后，結(jié)合S1核酸酶水解，可確定內(nèi)含子在基因組DNA中的定位；修整漸進(jìn)性刪除突變的末端。主要用途：去除DNA片段的單鏈突出端，使之成為平端；726.

逆轉(zhuǎn)錄酶

(reversetranscriptase)

逆轉(zhuǎn)錄酶又稱依賴RNA的DNA聚合酶。該酶催化以單鏈RNA為模板生成雙鏈DNA的反應(yīng)。由于這一反應(yīng)中的遺傳信息的流動(dòng)方向正好與絕大多數(shù)生物轉(zhuǎn)錄生成方向(即以DNA為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA的方向)相反，所以此反應(yīng)稱為逆轉(zhuǎn)錄作用。

6.

逆轉(zhuǎn)錄酶

(reversetranscripta73逆轉(zhuǎn)錄酶具有三種活性：RNA指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)；DNA指導(dǎo)的DNA合成的反應(yīng)；RNA的水解反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄酶具有三種活性：RNA指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)；74二、基因工程載體

理想的基因工程載體應(yīng)具備以下特征：

(1)能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制。在外源DNA插入其DNA之后，仍能保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。

(2)易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化。

二、基因工程載體理想的基因工程載體應(yīng)具備以下特征：

75（3）在其DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶單一酶切位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位于DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可以在這些位點(diǎn)上插入外源DNA，但不影響載體自身DNA的復(fù)制。

(4)具有能夠直接觀察的表型特征，在插入外源DNA后，這些特征可以作為重組DNA選擇的標(biāo)志。（3）在其DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶單一酶切位點(diǎn)，這些76基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件77常見的基因載體有：

細(xì)菌質(zhì)粒載體λ噬菌體載體柯氏質(zhì)粒載體病毒載體等常見的基因載體有：78（一）質(zhì)粒載體

(plasmid)

質(zhì)粒：是存在于染色體外能獨(dú)立復(fù)制，穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒DNA分子可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在特定情況下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到子一代。質(zhì)粒廣泛分布于原核生物細(xì)胞中，也存在于某些真核細(xì)胞中。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量變化很大，有一至幾個(gè)，也有幾十個(gè)，甚至數(shù)百個(gè)。（一）質(zhì)粒載體

(plasmid)

質(zhì)粒：是存在于染79質(zhì)粒的大小差異很大，小的不到1kb，大的超過500kb。幾乎所有的細(xì)菌株系都含有質(zhì)粒。質(zhì)粒的類型

F質(zhì)粒：攜帶幫助其自身從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一個(gè)細(xì)胞的信息質(zhì)粒R質(zhì)粒：表達(dá)對(duì)一種抗生素抗性的質(zhì)粒；降解質(zhì)粒：攜帶參與或控制一些不同尋常的代謝途徑基因的質(zhì)粒質(zhì)粒的大小差異很大，小的不到1kb，大的超過500kb。幾乎80質(zhì)粒的命名：通常用一個(gè)小寫的p來代表質(zhì)粒，而用一些英文縮寫或數(shù)字來對(duì)這個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行描述。以PBR322為例，BR代表研究出這個(gè)質(zhì)粒的研究者Boli—var和Rogigerus，322是與這兩個(gè)科學(xué)家有關(guān)的數(shù)字編號(hào)。

質(zhì)粒的命名：通常用一個(gè)小寫的p來代表質(zhì)粒，而用一些英文縮寫或81構(gòu)建一種質(zhì)粒載體，對(duì)質(zhì)粒通常有以下幾個(gè)方面的要求：

（1）質(zhì)粒載體的相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)盡可能小。（2）應(yīng)該有用來克隆外源DNA的單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；（3）應(yīng)該有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因。

（5）具有復(fù)制起始點(diǎn)

（4）質(zhì)?？截悢?shù)較高。構(gòu)建一種質(zhì)粒載體，對(duì)質(zhì)粒通常有以下幾個(gè)方面的要求：（1）質(zhì)82幾種常用的質(zhì)粒載體

1、質(zhì)粒載體pBR322

2、質(zhì)粒載體pUCl9

3、酵母質(zhì)粒載體

4、農(nóng)桿菌質(zhì)粒栽體

(1)土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒(2)土壤發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒載體

幾種常用的質(zhì)粒載體1、質(zhì)粒載體pBR322

2、質(zhì)粒載體p83（二）

噬菌體載體

細(xì)菌質(zhì)粒載體最大可以克隆的DNA片段一般在10kb左右，若要構(gòu)建一個(gè)基因文庫，往往需要克隆更大一些的DNA片段，為滿足這一要求，人們把噬菌體發(fā)展成為一種克隆載體。

1.

噬菌體的特點(diǎn)

噬菌體(phage)：寄生在細(xì)菌中的病毒，又稱細(xì)菌病毒。噬菌體由蛋白質(zhì)外殼和頭部外殼內(nèi)的DNA組成。（二）

噬菌體載體細(xì)菌質(zhì)粒載體最大可以克隆的DNA片段一般84

噬菌體作為載體，可插入10～20kb甚至更大的一段外源DNA片段。由于噬菌體具有較高的增殖能力，有利于目的基因的擴(kuò)增，從而成為當(dāng)前基因工程研究的重要載體之一。其中λ噬菌體就是目前基因克隆中最常用的一種。噬菌體作為載體，可插入10～20kb甚至更大的852.

λ噬菌體

λ噬菌體是一種溫和噬菌體，在其生活史中，它將DNA注入大腸桿菌之后，可以進(jìn)入溶菌和溶源兩種循環(huán)。當(dāng)λ噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)，20min后就可使宿主細(xì)胞發(fā)生裂解，同時(shí)釋放出大約100個(gè)噬菌體顆粒。當(dāng)λ噬菌體進(jìn)入溶源循環(huán)，即注入的DNA整合到大腸桿菌的染色體中，與染色體一起復(fù)制，而并不給寄主帶來任何危害。當(dāng)在某種營(yíng)養(yǎng)條件或是環(huán)境脅迫條件下，整合的λ噬菌體DNA可以被切割出來，進(jìn)入裂解循環(huán)。2.

λ噬菌體

λ噬菌體是一種溫和噬菌體，86

λ噬菌體是一種線狀雙鏈分子，長(zhǎng)約50kb，具有60多個(gè)基因，基因組分幾個(gè)不連續(xù)的區(qū)域，

λ噬菌體DNA大約50kb，其中大約20kb對(duì)于整合/切割過程極為關(guān)鍵，稱為整合/切割（I/E）區(qū)域。對(duì)于構(gòu)建基因文庫來說，可將這20kbDNA片段去掉，強(qiáng)迫重組的λ噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。

λ噬菌體是一種線狀雙鏈分子，長(zhǎng)約50kb，具有60多873.M13載體

M13載體：是一種細(xì)絲狀的特異性的大腸桿菌噬菌體，又叫單鏈?zhǔn)删w載體。它含有6kb～7kb的單鏈環(huán)狀DNA，在基因Ⅱ和V之間(共有10個(gè)基因)有一個(gè)508bp的非必需區(qū)，可插入外源DNA而不影響噬菌體的增殖。3.M13載體

M13載體：是一種細(xì)絲狀的特異性的大88

M13作為載體有兩個(gè)特性：

一是允許包裝大于病毒單位長(zhǎng)度的外源DNA。二是感染細(xì)菌后，復(fù)制環(huán)狀DNA經(jīng)包裝形成噬菌體顆粒，分泌到細(xì)胞外而不溶菌。這些特性不僅便于分離單鏈的DNA，而且在產(chǎn)生大量的單鏈DNA中，含有外源DNA序列。因此，可用于DNA序列分析，用于制備雜交探針，用于定點(diǎn)突變等

M13作為載體有兩個(gè)特性：89（三）黏性質(zhì)粒載體

也有人稱柯斯質(zhì)粒，是指含有抗性基因、單克隆位點(diǎn)以及λDNACOS位點(diǎn)的細(xì)菌質(zhì)粒。

柯斯質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存。因此柯斯質(zhì)粒綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點(diǎn)?？滤官|(zhì)粒上有多個(gè)單克隆位點(diǎn)(RE2)，兩個(gè)COS位點(diǎn)，即DNA復(fù)制啟始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個(gè)COS位點(diǎn)之間還有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（REl）。

（三）黏性質(zhì)粒載體

也有人稱柯斯質(zhì)粒，是指含有抗性基因、單90

重組噬菌體的DNA進(jìn)入大腸桿菌之后，由于進(jìn)入頭部時(shí)兩個(gè)COS位點(diǎn)都已被切割掉了，它們通過堿基配對(duì)可以將整個(gè)DNA分子變成一個(gè)環(huán)狀的質(zhì)粒分子。復(fù)制起始位點(diǎn)的存在又可以保證其在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制保存，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以通過抗生素進(jìn)行篩選?？滤官|(zhì)粒適用于作基因簇和大基因的克隆。

重組噬菌體的DNA進(jìn)入大腸桿菌之后，由于進(jìn)入頭91第三節(jié)基因工程的基本技術(shù)一、

目的基因的獲得與序列分析（一）目的基因的獲得

基因工程主要是通過人工的方法，分離、改造、擴(kuò)增并表達(dá)生物的特定基因，以獲得有價(jià)值的基因產(chǎn)物。目的基因的分離是基因工程操作的第一步。第三節(jié)基因工程的基本技術(shù)一、

目的基因的獲得與序列分析92

通常，我們把插入到載體內(nèi)的非自身的DNA片段稱為“外源基因”(foreigngene)。

目的基因(objectivegene)：又叫靶基因(targetgene)，是指根據(jù)基因工程的目的,設(shè)計(jì)的所需要的某些DNA分子片段，它含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼(code)

通常，我們把插入到載體內(nèi)的非自身的DNA片段稱93

目前采用的分離、合成目的基因的常用方法有：1.鳥槍法（霰彈槍法）具體做法是：首先利用物理方法（如剪切力、超聲波等）或酶化學(xué)方法（如限制性內(nèi)切核酸酶）將生物細(xì)胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，而后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌中擴(kuò)增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結(jié)合篩選方法，從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含有某種基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。這種方法也就是應(yīng)用基因工程技術(shù)分離目的基因。其特點(diǎn)是繞過直接分離基因的難關(guān)，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因。目前采用的分離、合成目的基因的常用方法有：1.鳥槍942.

物理化學(xué)法

利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對(duì)、A和T配對(duì)的這一特性，從生物基因組分離目的基因的方法。常用的分離基因的物理化學(xué)法主要方法有：密度梯度離心法；單鏈酶法；分子雜交法。

2.

物理化學(xué)法

利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C95（1）密度梯度離心法：

根據(jù)液體在離心時(shí)其密度隨轉(zhuǎn)軸距離而增加，堿基GC配對(duì)的雙鏈DNA片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術(shù)可使切割適當(dāng)片段的不同DNA按密度大小分布開來，進(jìn)而通過與某種放射性標(biāo)記的mRNA雜交來檢驗(yàn)，分離相應(yīng)的基因。（1）密度梯度離心法：96（2）單鏈酶法：

堿基GC配對(duì)之間有三個(gè)氫鍵，比AT配對(duì)的穩(wěn)定性高。當(dāng)用加熱或其他變性試劑處理DNA時(shí)，雙鏈上AT配對(duì)較多的部位先變成單鏈，應(yīng)用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，再經(jīng)氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的DNA（2）單鏈酶法：97（3）分子雜交法：

單鏈DNA與其互補(bǔ)的序列總有“配對(duì)成雙”的傾向，如DNA：DNA配對(duì)或者DNA：RNA配對(duì)，這就是分子雜交的原理。利用分子雜交的基本原理既可以分離又可以鑒別某一基因。（3）分子雜交法：983.化學(xué)合成法

是以單核苷酸為原料，在體外用化學(xué)方法按照已知基因的堿基順序合成DNA短片段，再依次連接成完整的目的基因鏈。此法必須預(yù)先知道目的基因或其mRNA或蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即核苷酸或氨基酸的順序。為了保證定向合成，需要將一個(gè)分子的5’端與另一個(gè)分子的3′端封閉保護(hù)。這種封閉可用磷酸化等方法，必要時(shí)可以酸或堿解除封閉。

3.化學(xué)合成法

是以單核苷酸為原料，在體99

化學(xué)合成法的最大優(yōu)點(diǎn)是能按照人們的意愿合成突變基因。但有局限性，要合成較長(zhǎng)鏈的DNA分子尚有困難。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程操作儀器設(shè)備也不斷更新。如日本Zeon公司已成功制成并出售“全自動(dòng)DNA合成儀”，精工電子工業(yè)公司的“DNA序列儀”。目前單鏈DNA短片段的合成已經(jīng)成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)了?；瘜W(xué)合成法的最大優(yōu)點(diǎn)是能按照人們的意愿合成突變1004.酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法

酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法即利用逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成相應(yīng)的DNA方法。主要用于合成分子量較大而又不知其序列的基因。這種方法是以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的DNA(cDNA)，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合后轉(zhuǎn)入受體菌，擴(kuò)增為cDNA文庫。然后，采用適當(dāng)?shù)姆椒◤腸DNA文庫中篩選出目的基因。如：1972年采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成了家兔和人球蛋白的cDNA。4.酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法

酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法即1015.PCR擴(kuò)增法

當(dāng)巳知目的基因的序列時(shí)，通常利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來分離目的基因。它能快速、簡(jiǎn)便地在體外擴(kuò)增特定的DNA片段，具有高度的專一性和靈敏度。5.PCR擴(kuò)增法

當(dāng)巳知目的基因的序列時(shí)，通常利用多聚酶鏈102

PCR反應(yīng)體系應(yīng)具備的條件：

（1）要有與被分離的目的基因的DNA雙鏈兩端序列相互補(bǔ)的DNA引物(約20個(gè)堿基左右)；（2）具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNA聚合酶；（3）dNTP；（4）作為模板的目的DNA序列。一般PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出100～5000bp的目的基因。PCR反應(yīng)體系應(yīng)具備的條件：103

PCR反應(yīng)過程包括：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如此反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)左右，即可擴(kuò)增得到目的DNA序列

PCR反應(yīng)過程包括：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙104（二）DNA序列測(cè)定

DNA序列分析(DNAsequencing)：指對(duì)某一段DNA分子或片段的核苷酸排列順序測(cè)定，也就是測(cè)定組成DNA分子的A、T、G、C的排列順序。測(cè)序也常常用于對(duì)重組DNA的序列分析，其結(jié)果是最直接、最客觀反映重組DNA中有無目的基因的方法。（二）DNA序列測(cè)定

DNA序列分析(DNAsequenc105

核苷酸序列測(cè)定的方法有：化學(xué)降解法酶促法（雙脫氧終止法）自動(dòng)測(cè)序法PCR測(cè)序法核苷酸序列測(cè)定的方法有：1061.化學(xué)降解法

也叫Maxam-Gilbert法。原理：用一些特殊的化學(xué)試劑，分別作用于DNA序列中四種不同的堿基。這些堿基經(jīng)過處理后，在核苷酸序列中形成的糖苷鍵連接變?nèi)?，因此很容易從DNA鏈上脫落下來。丟失了堿基的核苷酸鏈再經(jīng)適當(dāng)處理，就可在缺失堿基處斷裂。在進(jìn)行這些反應(yīng)時(shí)，將反應(yīng)條件控制在每條DNA鏈斷開一處，因此經(jīng)過處理，產(chǎn)生一系列長(zhǎng)短不等的DNA片段。根據(jù)所用的試劑不同，其末端分別為G、A、C、T，再對(duì)一系列這樣的片段進(jìn)行綜合分析，就可測(cè)得DNA分子中的核苷酸排列順序。1.化學(xué)降解法也叫Maxam-Gilbert1072.

酶促法

又叫Sanger法和鏈終止法。原理：先將DNA分子用限制性內(nèi)切酶切割成片段，然后用電泳依其長(zhǎng)短不同分離，鈍化單股片段，以32P標(biāo)記其5’末端，并用以作為復(fù)制其互補(bǔ)片段的模板，在復(fù)制過程中，利用從大腸桿菌提取的DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理而得的大片段，以復(fù)制互補(bǔ)單股DNA，從而求得其序列。2.

酶促法又叫Sanger法和鏈終止法。1083.自動(dòng)化測(cè)序法

Prober等1987年將鏈終止法加以改進(jìn)，并與電子計(jì)算機(jī)程序的自動(dòng)化技術(shù)相結(jié)合，加快了序列測(cè)定，并且不用放射性同位素標(biāo)記脫氧核苷酸，避免了放射線對(duì)操作者的危害。實(shí)際做法：在每種脫氧核苷酸上分別都以共價(jià)鍵接上不同熒光染料，然后與四種三磷酸核苷在同一器皿中，依照上述鏈終止法條件進(jìn)行，即會(huì)復(fù)制出一系列不斷增加較長(zhǎng)一點(diǎn)的多聚脫氧核苷酸鏈，其3’末端都各自帶有特色熒光染料的雙脫氧核苷酸，為了測(cè)定序列，將反應(yīng)混合物在一條道上進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果這條道上出現(xiàn)一系列有熒光的帶。3.自動(dòng)化測(cè)序法

Prober等1987年將鏈終止法加以109

這些有熒光的帶中每一條都代表一個(gè)堿基在復(fù)制鏈中所在的位置。凝膠熒光測(cè)定體系由電子計(jì)算機(jī)控制。這個(gè)體系是用激光激發(fā)不同顏色的染料所發(fā)生的熒光，用短波長(zhǎng)的藍(lán)光及長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光分別測(cè)量熒光強(qiáng)度之比值，測(cè)定在復(fù)制鏈中各堿基的位置，從而得到DNA的序列。熟練的操作者用這種方法一天可測(cè)1000個(gè)以上的堿基，而現(xiàn)在其他測(cè)序方法一般一人一年只能測(cè)50000個(gè)堿基。這種方法因用電子計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化操作，大大縮短測(cè)定時(shí)間，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是目前最優(yōu)越的測(cè)序方法。這些有熒光的帶中每一條都代表一個(gè)堿基在復(fù)制鏈中110二、目的基因與載體的連接

通過不同的途徑獲取了目的基因，選擇或構(gòu)建適當(dāng)?shù)幕蜉d體之后，基因工程的下一步工作是如何將目的基因與載體連接在一起，即DNA的體外重組。基因重組是基因工程的核心。

基因重組(generecombination)，就是將目的基因與載體DNA兩者連接起來。這種連接主要靠T4DNA連接酶。二、目的基因與載體的連接通過不同的途徑獲取了目111

通常連接的形式有：黏性末端連接平端連接人工接頭連接同聚物加尾連接

通常連接的形式有：112（一）黏性末端連接

黏性末端連接有兩種情況。

同一限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接

由同一限制性內(nèi)切酶切割的不同DNA片段，會(huì)產(chǎn)生具有完全相同的黏性末端，在適合條件下。單鏈黏性末端間進(jìn)行堿基配對(duì)形成雙鏈，然后在T4DNA連接酶催化作用下使之共價(jià)連接，形成的重組DNA分子。（一）黏性末端連接

同一限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接113不同限制酶切位點(diǎn)連接

由兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段，產(chǎn)生具有相同類型的黏性末端，彼此稱為互補(bǔ)末端，也可以產(chǎn)生末端連接。不同限制酶切位點(diǎn)連接

114（二）

平端連接

一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaI切割產(chǎn)生的DNA片段是平齊末端。具有平齊末端的酶切載體只能與平齊末端的目的基因連接。

T4DNA連接酶可催化相同和不同限制性內(nèi)切酶切割的平端之間連接。（二）

平端連接

115（三）人工接頭連接

人工接頭是人工合成的具有特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端DNA短序列。將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內(nèi)切酶位點(diǎn)，應(yīng)用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，就可以分別得到互補(bǔ)的黏性末端。（三）人工接頭連接

116基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件117（四）同聚物加尾連接

利用末端轉(zhuǎn)移酶(也稱DNA轉(zhuǎn)移酶)在DNA片段上制造一個(gè)粘性末端的方法。如在目的基因片段的3’末端添加一小段同聚物(如dA堿基)，在載體3’末端添加一小段同聚物dT，形成堿基配對(duì)，而后在T4DNA連接酶催化作用下使之共價(jià)連接，形成的重組DNA分子。

（四）同聚物加尾連接利用末端轉(zhuǎn)移酶(也稱DNA轉(zhuǎn)移酶)在D118基因工程與食品產(chǎn)業(yè)課件119三、重組DNA向受體的轉(zhuǎn)化

在目的基因與載體連接成重組DNA分子以后，下面的重要工作主要是將其導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，獲得大量的重組DNA分子，這就是外源基因的無性繁殖，即克隆(cloning)。

由于外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì)不同、宿主細(xì)胞不同，將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的具體方法也不相同。三、重組DNA向受體的轉(zhuǎn)化

在目的基因與載體120常用的受體細(xì)胞以細(xì)菌為主，其中主要有大腸桿菌、枯草桿菌重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有：（1）轉(zhuǎn)化：是將重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，使受體遺傳性狀發(fā)生改變的方法；

常用的受體細(xì)胞以細(xì)菌為主，其中主要有大腸桿菌、121（2）轉(zhuǎn)染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過程。(其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法)磷酸鈣沉淀法

利用磷酸鈣-DNA共沉淀，把外源基因與λ噬菌體DNA的重組分子導(dǎo)入大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，簡(jiǎn)稱磷酸鈣沉淀法。細(xì)胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力，幾乎所有的雙鏈DNA都可以通過這種方法導(dǎo)入細(xì)胞，而且可在電子顯微鏡下清楚地看到細(xì)胞吞噬DNA-磷酸鈣復(fù)合顆粒。此法的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如體外包裝法。（2）轉(zhuǎn)染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)122體外包裝轉(zhuǎn)染法

體外包裝：指在體外將重組DNA放置到噬菌體的蛋白質(zhì)外殼里，然后通過正常的噬菌體感染過程，將它們導(dǎo)入宿主細(xì)胞。將重組DNA噬菌體包裝成噬菌體顆粒，使其能夠感染細(xì)菌，并在宿主菌體內(nèi)擴(kuò)增和表達(dá)外源基因。

體外包裝轉(zhuǎn)染法

123又稱之為直接顯微注射。一般是用微吸管吸取供體DNA溶液，在顯微鏡下準(zhǔn)確地插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去。此法常用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移。（3）微注射技術(shù)：是將外源基因直接注射到真核細(xì)胞內(nèi)的方法；又稱之為直接顯微注射。一般是用微吸管吸取供體DNA溶液，在顯124（4）電轉(zhuǎn)化法也有人稱做高壓電穿孔法（簡(jiǎn)稱電穿孔法），即在受體細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，使質(zhì)膜形成納米大小的微孔，DNA能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時(shí)所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。該法可用于真核細(xì)胞(如動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞)和原核細(xì)胞(轉(zhuǎn)化大腸桿菌和其他細(xì)菌等)的外源DNA的直接導(dǎo)入。

電穿孔法具有簡(jiǎn)便、快速、效率高等優(yōu)點(diǎn)（4）電轉(zhuǎn)化法也有人稱做高壓電穿孔法（簡(jiǎn)稱電穿孔法），即在受125又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法、高速粒子轟擊法基本原理：將DNA吸附在微型子彈(1μm)的表面通過放電或機(jī)械加速，使子彈射入完整的細(xì)胞或組織內(nèi)?；咀龇ǎ合葘⑼庠碊NA溶液與鎢、金等金屬微粒(直徑0.5-5μm)共同保溫，使DNA吸附于金屬顆粒表面，然后放電加速金屬顆粒，使之以400m/s的速度直接噴射受體細(xì)胞，外源遺傳物質(zhì)隨金屬顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。（5）基因槍技術(shù)又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法、高速粒子轟擊法（5）基因126（6）脂質(zhì)體介導(dǎo)法（7）其他方法：很多高效的新穎的導(dǎo)入方法，如加速冷凍法、碳化硅纖維介導(dǎo)法等正在研究并逐漸達(dá)到實(shí)用水平。

脂質(zhì)體(又叫做人工膜泡)作為體內(nèi)或體外輸送載體的方法，一般都需要將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，通過融合導(dǎo)入細(xì)胞。（6）脂質(zhì)體介導(dǎo)法（7）其他方法：

脂質(zhì)體(又叫做人工膜127

受體細(xì)胞：也叫宿主細(xì)胞，是指在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交中接受外源基因的細(xì)胞。分為原核受體細(xì)胞(最主要是大腸桿菌)、真核受體細(xì)胞(最主要是酵母菌)、動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞(其實(shí)也是真核受體細(xì)胞)。

具有接受外源DNA的能力；為限制性內(nèi)切酶缺陷型菌珠或?yàn)镈NA重組型菌珠；在標(biāo)記上和載體對(duì)應(yīng)；有利于表達(dá)；不適宜在人體或非培養(yǎng)條件下生存，有利于安全。受體細(xì)胞：也叫宿主細(xì)胞，是指在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交中接受外源基128

大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細(xì)胞。通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，即在冰浴中用一定濃度的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細(xì)胞。

感受態(tài)是指受體細(xì)胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。一般受體細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細(xì)胞。通常129四、重組體的篩選與外源基因的鑒定（一）重組體的篩選

基因克隆的下一道工序是：從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選含有陽性重組DNA分子的菌落，并鑒定重組DNA分子的正確性。四、重組體的篩選與外源基因的鑒定（一）重組體的篩選基因克1301、針對(duì)遺傳表型篩選按載體的性狀變化進(jìn)行篩選根據(jù)插入基因的遺傳性狀進(jìn)行篩選。2、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選快速裂解菌落，鑒定分子大小內(nèi)切酶圖譜鑒定PCR篩選重組子核酸分子雜交1、針對(duì)遺傳表型篩選按載體的性狀變化進(jìn)行篩選2、根據(jù)重組子的131（二）

重組體的鑒定

經(jīng)過轉(zhuǎn)化的重組體，如轉(zhuǎn)基因微生物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)在其形成了一定的菌株、品系之后，就需要對(duì)它們進(jìn)行鑒定，檢驗(yàn)它們?cè)谏L(zhǎng)發(fā)育、傳種接代過程中是否保留了已獲得的外源基因。

（二）

重組體的鑒定經(jīng)過轉(zhuǎn)化的重組體，如轉(zhuǎn)基因微生物1321、

報(bào)告基因的檢測(cè)法

是一種快速而簡(jiǎn)易地區(qū)分轉(zhuǎn)基因生物和非轉(zhuǎn)基因生物的方法。報(bào)告基因檢測(cè)法：指在構(gòu)建目的基因時(shí)將一種報(bào)告基因(如GUS基因)構(gòu)建在一起，當(dāng)目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因一同被轉(zhuǎn)入。報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。1、

報(bào)告基因的檢測(cè)法

是一種快速而簡(jiǎn)易地區(qū)分轉(zhuǎn)基因生1332、分子雜交技術(shù)

為了從分子水平鑒定目的基因是否已經(jīng)整合到受體細(xì)胞中，是否轉(zhuǎn)錄，是否表達(dá)，經(jīng)常用到基因探針雜交技術(shù)。即用已知基因片段(往往是目的基因片段)制作的探針，與待測(cè)樣品的基因片段進(jìn)行核酸分子雜交，從而判斷二者的同源程度。目前已廣泛應(yīng)用于食品生物技術(shù)的研究中。這種技術(shù)通常包括原位雜交、點(diǎn)雜交、Southern吸印雜交、Northern吸印雜交、Western吸印雜交等。后三者需要瓊脂糖凝膠電泳與分子雜交相結(jié)合的分析手段。2、分子雜交技術(shù)

為了從分子水平鑒定目的基因是否已經(jīng)整合134（1）點(diǎn)雜交：將待測(cè)DNA或RNA或細(xì)胞裂解物變性后直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，不需限制性酶進(jìn)行酶切，即可與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。該技術(shù)對(duì)于基因拷貝數(shù)多的樣品很適合，具有間接快速的特點(diǎn)，一般可作大批量樣品的篩選。

（2）Southern吸印雜交：是1975年由Southern首創(chuàng)的，以后又由多人改造，目前被認(rèn)為是最經(jīng)典和應(yīng)用最廣泛的雜交力方法。根據(jù)基因探針與待測(cè)DNA限制酶的酶解片段雜交帶譜，可以直接確定是否已經(jīng)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并接合到受體細(xì)胞的基因組中。（1）點(diǎn)雜交：將待測(cè)DNA或RNA或細(xì)胞裂解物變性后直接點(diǎn)在135

基本原理和操作過程是：提取重組體DNA，限制性酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在堿溶液中使DNA變性即雙鏈變?yōu)閱捂湥俳?jīng)毛細(xì)管虹吸作用被原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將膜上的DNA烤干，固定后加入雜交液和標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗去多余探針，在X光底片上放射自顯影。

基本原理和操作過程是：提取重組體DNA，限制性酶切后進(jìn)行瓊136（3）

Northern吸印雜交基本原理與Southern大致相同，只是檢測(cè)的對(duì)象不是DNA，而是RNA。具體做法是：提取重組體總RNA或mRNA，在強(qiáng)變性劑如甲基汞或甲醛存在的情況下(防止RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)環(huán))，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后，將電泳分離開的RNA原位吸印到經(jīng)化學(xué)處理過的紙或硝酸纖維素膜上，用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，然后放射自顯影，根據(jù)X光片上的條帶，可以了解與探針互補(bǔ)的RNA的大小及數(shù)量。由于RNA比DNA更易受到各種因素的降解，整個(gè)操作過程必須十分小心，按規(guī)程操作。對(duì)轉(zhuǎn)基因生物Northern雜交顯示陽性，說明外源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入受體基因組中，并且順利地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成mRNA。（3）

Northern吸印雜交137（4）

Western吸印雜交：主要用于檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)情況，即是否進(jìn)行了翻譯，產(chǎn)生了外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。具體做法是：提取重組體蛋白質(zhì)，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠上原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，最后進(jìn)行抗體與抗原結(jié)合反應(yīng)。

（4）

Western吸印雜交：138（5）原位(菌落)雜交技術(shù)：

是利用核酸雜交原理檢測(cè)含有待測(cè)DNA序列的重組分子。在許多情況下，含有理想重組體的細(xì)菌往往混雜在含有其他重組分子的細(xì)菌之中，當(dāng)理想重組體的存在無法用遺傳方法檢測(cè)時(shí)，必須考慮其他篩選方法，原位(菌落)雜交法是最常用的方法之一。

（5）原位(菌落)雜交技術(shù)：

139大致過程：先通過一定方法，讓菌落轉(zhuǎn)移到一種支撐膜上，如硝酸纖維素濾膜，然后裂解膜上的細(xì)菌，使DNA變性并原位結(jié)合在濾膜上，將帶有DNA印跡的濾膜與放射性標(biāo)記的RNA或DNA探針雜交。在雜交后，先洗未雜交的探針，再進(jìn)行放射性自顯影，與探針有同源性的DNA印跡將會(huì)顯露在X光片上。顯然，提供這種DNA的菌落包含著理想的DNA序列，可從主盤中找到那個(gè)相應(yīng)的菌落。

大致過程：先通過一定方法，讓菌落轉(zhuǎn)移到一種支撐膜上，如硝酸纖140第六節(jié)反義基因技術(shù)一、反義基因技術(shù)的基本概念和原理

反義RNA(antisenseRNA)：有義DNA鏈轉(zhuǎn)錄成的、與特異的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合并能抑制靶RNA表達(dá)的一段序列。反義ＲＮＡ是一類能與特異ｍＲＮＡ互補(bǔ)的小分子量、可擴(kuò)散的ＤＮＡ轉(zhuǎn)錄物，它能夠從翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平和核酸復(fù)制水平上高度特異地抑制靶基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的基因稱之為反義基因。第六節(jié)反義基因技術(shù)一、反義基因技術(shù)的基本概念和原理反141反義RNA技術(shù)：指把一段DNA序列以反義方向插入到合適的啟動(dòng)子和終止子之間，然后把此基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中去(通常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法)，通過選擇培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化生物體的技術(shù)。

。

反義RNA技術(shù)：指把一段DNA序列以反義方向插入到合適的啟動(dòng)142反義基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法：第一步，分離得到的mRNA為模板，合成反義DNA；第二步，以此反義鏈為模板合成有義DNA鏈；第三步，以細(xì)菌質(zhì)粒(DNA)為載體，用限制性內(nèi)切酶在靠近啟動(dòng)子處切割一缺口；第四步，將有義DNA插入表達(dá)載體的缺口中，即得到一表達(dá)質(zhì)粒，如果啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)載體即轉(zhuǎn)錄原來的mRNA；如果將插入的表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶切割后，以相反的方向插入載體DNA環(huán)中，即表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄形成反義RNA。反義基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法：第一步，分離得到的mRNA為模板143二、

反義基因技術(shù)的特點(diǎn)

1、反義RNA可以高度專一地調(diào)節(jié)某一特定基因的表達(dá)，不影響其他基因的表達(dá)。2、轉(zhuǎn)化到植物中的反義RNA的作用類似于遺傳上的缺陷型，表現(xiàn)為顯性。所以被轉(zhuǎn)化的植物材料不必為純合體就可表現(xiàn)相應(yīng)的性狀，從而避免了二倍體內(nèi)等位基因的顯隱性干擾。二、

反義基因技術(shù)的特點(diǎn)1、反義RNA可以高度專一地調(diào)節(jié)某144

3、反義基因整合到植物的基因組中可獨(dú)立表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，后代符合孟德爾遺傳規(guī)律。4、反義基因不必了解其目的基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可省去對(duì)基因產(chǎn)物的研究工作。5、反義基因不改變目的基因的結(jié)構(gòu)，在應(yīng)用上更加安全。

3、反義基因整合到植物的基因組中可獨(dú)立表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，后代145三、

反義基因技術(shù)的應(yīng)用

世界上第一個(gè)基因工程商業(yè)化園藝產(chǎn)品，就是利用反義基因技術(shù)將反義PG基因轉(zhuǎn)入番茄得到的耐貯運(yùn)的番茄。以反義PG番茄為例，介紹其培育過程：

三、

反義基因技術(shù)的應(yīng)用世界上第一個(gè)基因工146

首先，通過一定的方法如反轉(zhuǎn)錄方法、化學(xué)合成方法或者篩選基因文庫等方法得到目的基因PG。第二步，構(gòu)建反義PG基因重組子，即PG基因反向構(gòu)建到適宜的載體上，如農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒?；蛘咝枰ㄟ^一個(gè)中間載體如大腸桿菌質(zhì)粒再轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上。利用載體本身所帶的抗生素基因?qū)?gòu)建后的重組子進(jìn)行篩選，然后進(jìn)一步鑒定。

首先，通過一定的方法如反轉(zhuǎn)錄方法、化學(xué)合成方法或者篩選基因147第三步，利用攜帶反義PG基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，通過葉盤法進(jìn)行轉(zhuǎn)化番茄子葉或者下胚軸。

第四步，被轉(zhuǎn)化的番茄子葉或者下胚軸在含有一定濃度的抗生素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)歷愈傷組織形成、發(fā)芽、生根等過程，逐漸形成一顆完整植株。第五步，對(duì)再生植株進(jìn)行鑒定，如點(diǎn)雜交、Southern雜交、Northern雜交和性狀觀察等，檢測(cè)外源基因是否已經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)等。第三步，利用攜帶反義PG基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，通過葉盤法進(jìn)行148第六步，對(duì)正確表達(dá)目的基因的植株進(jìn)行選育，獲得純合體后代，通過安全評(píng)價(jià)程序，進(jìn)行田間釋放、中試和商業(yè)化生產(chǎn)。

第六步，對(duì)正確表達(dá)目的基因的植株進(jìn)行選育，獲得純合體后代，通149第四節(jié)

基因工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用

一、

利用基因工程改造食品微生物

（一）

改良微生物菌種

最早成功應(yīng)用的基因工程菌(采用基因工程改造的微生物)是面包酵母菌。

啤酒生產(chǎn)中要使用啤酒酵母，但由于普通啤酒酵母菌種中不含α-淀粉酶，所以需要利用大麥芽產(chǎn)生的α-淀粉酶使谷物淀粉液化成糊精，生產(chǎn)過程比較復(fù)雜。第四節(jié)

基因工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用一、

利用基因工程改1502001年我國(guó)啤酒年產(chǎn)量2300萬噸（世界第二），產(chǎn)值426億元人民幣。生物技術(shù)已用于啤酒酵母的改造，如將α－乙酰乳酸脫羧酶基因克隆到啤酒酵母中進(jìn)行表達(dá)，可降低啤酒雙乙酰含量而改善啤酒風(fēng)味；選育出分解β－葡聚糖和糊精的啤酒酵母，能夠明顯提高麥汁的分解率并改善啤酒質(zhì)量；構(gòu)建具有優(yōu)良嗜殺其他菌類活性的嗜殺啤酒酵母已成為實(shí)現(xiàn)純種發(fā)酵的重要措施。

2001年我國(guó)啤酒年產(chǎn)量2300萬噸（世界第二），產(chǎn)值426151

采用基因工程技術(shù)，將大麥中α-淀粉酶基因轉(zhuǎn)入啤酒酵母中并實(shí)現(xiàn)高速表達(dá)。這種酵母便可直接利用淀粉進(jìn)行發(fā)酵，無需麥芽生產(chǎn)α-淀粉酶的過程，可縮短生產(chǎn)流程，簡(jiǎn)化工序，推動(dòng)啤酒生產(chǎn)的技術(shù)革新。

利用基因工程技術(shù)還可將霉菌的淀粉酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并將此基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)入單細(xì)胞酵母中，使之直接利用淀粉生產(chǎn)酒精。這樣，可以省掉酒精生產(chǎn)中的高壓蒸煮工序，可節(jié)約能源60％，并且生產(chǎn)周期大大縮短。采用基因工程技術(shù)，將大麥中α-淀粉酶基因轉(zhuǎn)入啤152此外，食品生產(chǎn)中所應(yīng)用的食品添加劑或加工助劑，如氨基酸、有機(jī)酸、維生素、增稠劑、乳化劑、表面活性劑、食用色素，食用香精及調(diào)味料等，也可以采用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)而得到，基因工程對(duì)微生物菌種改良前景廣闊。

此外，食品生產(chǎn)中所應(yīng)用的食品添加劑或加工助劑，如氨基153（二）

改良乳酸菌遺傳特性

1、抗藥基因

目前，利用乳酸菌發(fā)酵得到的產(chǎn)品很多，如酸奶、干酪、酸奶油、酸乳酒等，已應(yīng)用的乳酸菌基本上為野生菌株。有的野生菌株本身就抗多種抗生素，因而在其使用過程中，抗藥基因?qū)⒂锌赡芤越Y(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等形式在微生物菌群之間相互傳遞而發(fā)生擴(kuò)散。

（二）

改良乳酸菌遺傳特性

1、抗藥基因154

利用基因工程技術(shù)可選育無耐藥基因的菌株，當(dāng)然也可去除生產(chǎn)中已應(yīng)用菌株中含有的耐藥質(zhì)粒，從而保證食品用乳酸菌和活菌制劑中菌株的安全性。

2、風(fēng)味物質(zhì)基因

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中與風(fēng)味有關(guān)的物質(zhì)主要有乳酸、乙醛、丁二酮、3-羥基-2-丁酮、丙酮和丁酮等?？梢酝ㄟ^基因工程選育風(fēng)味物質(zhì)含量高的乳酸菌菌株。利用基因工程技術(shù)可選育無耐藥基因的菌株，當(dāng)然也1553、產(chǎn)酶基因

乳酸菌不僅具有一般微生物所產(chǎn)生的酶系，而且還可以產(chǎn)生一些特殊的酶系，如產(chǎn)生有機(jī)酸的酶系、合成多糖的酶系、降低膽固醇的酶系、控制內(nèi)毒素的酶系、分解脂肪的酶系、合成各種維生素的酶系和分解膽酸的酶系等，從而賦予乳酸菌特殊的生理功能。若通過基因工程克隆這些酶系，然后導(dǎo)入到生產(chǎn)干酪、酸奶等發(fā)酵乳制品生產(chǎn)用乳酸菌菌株中，將會(huì)促進(jìn)和加速這些產(chǎn)品的成熟。另外，把膽固醇氧化酶基因轉(zhuǎn)到乳酸桿菌中，可降低乳中膽固醇含量。3、產(chǎn)酶基因

乳酸菌不僅具有一般微生物所產(chǎn)1564、耐氧相關(guān)基因

乳酸菌大多數(shù)屬于厭氧菌，這給實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)帶來諸多不便。從遺傳學(xué)和生化角度看，厭氧菌或兼性厭氧菌幾乎沒有超氧化物歧化酶基因和過氧化氫酶基因或者說其活性很小。若通過生物工程改變超氧化物歧化酶的調(diào)控基因則有可能提高其耐氧活性。當(dāng)然將外源SOD基因和過氧化氫酶基因轉(zhuǎn)入?yún)捬蹙校部梢云鸬教岣邊捬蹙图嫘詤捬蹙鷮?duì)氧的抵抗能力。4、耐氧相關(guān)基因

乳酸菌大多數(shù)屬于厭氧菌，這給實(shí)1575、產(chǎn)細(xì)菌素基因

乳酸菌代謝不僅可以產(chǎn)生有機(jī)酸等產(chǎn)物，還可以產(chǎn)生多種細(xì)菌素，然而并不是所有的乳酸菌都產(chǎn)生細(xì)菌素，若通過生物工程技術(shù)將細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因克隆到生產(chǎn)用菌株中，不僅可以使不產(chǎn)細(xì)菌素的菌株獲得產(chǎn)產(chǎn)細(xì)菌素的能力，而且為人工合成大量的細(xì)菌素提供了可能。5、產(chǎn)細(xì)菌素基因

乳酸菌代謝不僅可以產(chǎn)生有機(jī)酸等產(chǎn)物158（三）

酶制劑的生產(chǎn)

利用基因工程技術(shù)不但可以成倍地提高酶的活力，而且還可以將生物酶基因克隆到微生物中，構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)酶。據(jù)1995年統(tǒng)計(jì)，已有50％的工業(yè)用酶是用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)的。轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高、品質(zhì)均一、穩(wěn)定性好、價(jià)格低等。（三）

酶制劑的生產(chǎn)利用基因工程技術(shù)不但可以成倍地提高酶的159

凝乳酶是第一個(gè)應(yīng)用基因工程技術(shù)把小牛胃中的凝乳酶基因轉(zhuǎn)移至細(xì)菌或真核微生物生產(chǎn)的一種酶。1990年美國(guó)FDA已批準(zhǔn)在干酪生產(chǎn)中使用。

重組DNA技術(shù)生產(chǎn)小牛凝乳酶，首先從小牛胃中分離出對(duì)凝乳酶原專一的mRNA(內(nèi)含子已被切除)，然后借助反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶和St核苷酸酶的作用獲得編碼該酶原的雙鏈DNA。再以質(zhì)粒或噬菌體為運(yùn)載體導(dǎo)入大腸桿菌。

凝乳酶是第一個(gè)應(yīng)用基因工程技術(shù)把小牛胃中的凝乳160近20年來用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的食品酶制劑主要有：凝乳酶、α－淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、普魯多糖酶（茁霉多糖酶）、脂肪酶、α－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷酶、α－乙酰乳酸脫羧酶、溶菌酶、堿性蛋白酶等。

近20年來用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的食品酶制劑主要有：凝乳酶、α161

例如，蛋白酶可以改善蛋白質(zhì)的溶解性；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)，可用于增加大豆蛋白的膠凝性能，使肉制品等添加大豆蛋白后具有更好的品質(zhì)。

在食品加工過程中，通過添加一些酶類，可以改善產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。如用葡萄糖氧化酶可以去除蛋液中的葡萄糖，改善蛋制品的色澤；用脂酶和蛋白酶可加速奶酪的成熟；葡萄糖苷酶可用于果汁和果酒的增香；木瓜蛋白酶可分解膠原蛋白，用于肉的嫩化。對(duì)于含有難消化成分的食品，可以通過添加一些酶類，改善這些食品的營(yíng)養(yǎng)和消化利用性能。

例如，蛋白酶可以改善蛋白質(zhì)的溶解性；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以使蛋白162二、利用基因工程改善食品原料的品質(zhì)

（一）改良動(dòng)物食品性狀

為了提高乳牛的產(chǎn)奶量，可將采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的牛生長(zhǎng)激素(BST)注射到母牛體內(nèi)，既可達(dá)到提高母牛產(chǎn)奶量的目的，又不影響奶的質(zhì)量。同樣，為了提高豬的瘦肉含量或降低豬脂肪含量，可將采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的豬生長(zhǎng)激素，注射至豬體內(nèi)，便可使豬瘦肉型化，有利于改善肉食品質(zhì)。二、利用基因工程改善食品原料的品質(zhì)（一）改良動(dòng)物食品性狀163鄰氨基苯甲酸合成酶基因的克隆過程是，首先將Brevibacteriumfiavum菌的染色體DNA酶解，而后克隆進(jìn)C．gutamicum大腸桿菌穿梭載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入C．glutamicum的突變體，這個(gè)突變體無法產(chǎn)生有活性的鄰氨基苯甲酸合成酶，然后讓轉(zhuǎn)化的突變體在不加鄰氨基苯甲酸合成酶的情況下生長(zhǎng)，如果菌在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)起來，就說明其中含有鄰氨基苯甲酸合成酶的基因。把長(zhǎng)起來的這些克隆的基因再轉(zhuǎn)到野生型的C．glutamicum中去，使色氨酸的合成能力提高130％左右。因此，增加一個(gè)氨基酸生物途徑中的某一個(gè)關(guān)鍵性基因的拷貝數(shù)，就有可能提高終產(chǎn)物的產(chǎn)量。鄰氨基苯甲酸合成酶基因的克隆過程是，首先將Brevi164（二）

改造植物性食品原料

1、提高植物性食品氨基酸含量

例如，可以對(duì)賴氨酸代謝途徑中的各種酶進(jìn)行修飾或加工，從而使細(xì)胞積累更大量的Lys。在植物細(xì)胞中，Lys是由Asp衍生而來的，在這個(gè)過程中有兩個(gè)起重要作用的酶，天冬氨酸激酶(AK)和二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)。這兩個(gè)酶都受到它們所催化的反應(yīng)的終產(chǎn)物-Lys抑制。因此只要能夠解除Lys對(duì)AK和DHDPS的抑制，就可以在細(xì)胞內(nèi)積累較高含量的Lys。現(xiàn)在已經(jīng)從玉米等植物中克隆到了對(duì)Lys的抑制作用不敏感的DHDPS的基因，并正在對(duì)轉(zhuǎn)入此基因的植物進(jìn)行檢測(cè)。（二）

改造植物性食品原料1、提高植物性食品氨基酸含量165

還可針對(duì)性地將富含某種特異性的氨基酸的蛋白基因轉(zhuǎn)入目的植物，以提高相應(yīng)植物中的特定氨基酸的含量。例如通過分析發(fā)現(xiàn)，玉米β-phaseolin富含Met，將此蛋白基因轉(zhuǎn)入豆科植物，就可以大大提高豆科植物種子貯存蛋白的Met含量，而Met正是豆科植物種子貯存蛋白所缺少的成分。還可針對(duì)性地將富含某種特異性的氨基酸的蛋白基因1662、增加食品的甜味

非洲有一種植物叫應(yīng)樂果，研究人員在其果實(shí)中發(fā)現(xiàn)了一種叫做應(yīng)樂果蛋白的蛋白質(zhì)，咀嚼時(shí)比蔗糖大約甜1.0萬倍，而它所含的蛋白質(zhì)卻又不會(huì)在新陳代謝中具有與蔗糖相同的作用，它的這種特性使之成為蔗糖的理想替代品。

2、增加食品的甜味非洲有一種植物叫應(yīng)樂果，研究人員167天然應(yīng)樂果蛋白是有兩條鏈通過弱的非共價(jià)鍵相互作用而形成的二聚體。A鏈由45個(gè)氨基酸殘基組成，B鏈由50個(gè)氨基酸殘基組成。但由于是由兩條分離多肽鏈組成，烹調(diào)過程中遇到的加熱、遇酸(例如醋酸、檸檬酸)等情況很容易使之解離，失去甜味。局限了它作為甜味劑的用途。

人們采用化學(xué)方法合成出應(yīng)樂果蛋白基因，它可以編碼同時(shí)包括A、B兩條鏈的單鏈肽段。此融合蛋白在轉(zhuǎn)基因番茄和萵苣中進(jìn)行了表達(dá)。天然應(yīng)樂果蛋白是有兩條鏈通過弱的非共價(jià)鍵相互作用而形168

還可用基因工程的方法獲得新的糖類。例如環(huán)化糊精(CD)就是一種新的糖類物質(zhì)。這