血庫(kù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1廣州華興康復(fù)醫(yī)院醫(yī)院血庫(kù)試驗(yàn)指導(dǎo)試驗(yàn)一 ABO血型鑒定一、正定型法【目的】通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)血型抗體鑒定紅細(xì)胞膜上ABO血型系統(tǒng)抗原，把握鹽水介質(zhì)法進(jìn)展ABO血型系統(tǒng)正定型的根本操作方法和結(jié)果推斷?！驹怼恳罁?jù)IgM類(lèi)特異性血型抗體與紅細(xì)胞膜上特異性抗原結(jié)合能夠消滅凝集反響的原理，用IgM類(lèi)特異性標(biāo)準(zhǔn)抗血清與被檢紅細(xì)胞在鹽水介質(zhì)中反響〔室溫，假設(shè)消滅【器材】小試管、尖滴管、載玻片〔或有凹槽的玻璃板〕或白瓷板、離心機(jī)、記號(hào)筆、蠟筆、顯微鏡。【試劑】標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B血清，生理鹽水。【標(biāo)本】外周血或靜脈血。【操作】5％被檢紅細(xì)胞生理鹽水懸液制備：抗凝血離心或紅細(xì)胞自然沉降后取下層紅細(xì)胞2滴于小試管中，加人生理鹽水2ml，用尖滴管將紅細(xì)胞與生理鹽水充分混勻，2500r/min3min3119滴生5％的紅細(xì)胞生理鹽水懸液?！惨弧巢Ｆ?塊，用蠟筆畫(huà)出小格，做好編號(hào)分別標(biāo)記抗A、抗B。加標(biāo)準(zhǔn)抗血清在玻片或白瓷板已標(biāo)記的區(qū)域內(nèi)分別滴加抗A,抗B1滴。加被檢紅細(xì)胞懸液在滴加抗A,抗B標(biāo)準(zhǔn)抗血清的小格中分別加被檢者5％紅細(xì)胞生理鹽水懸液各115～30min。觀看結(jié)果先輕輕搖動(dòng)玻片，肉眼觀看有無(wú)顆粒狀凝集及凝集程度，再用低倍鏡觀看，判定陰性、陽(yáng)性和陽(yáng)性程度。推斷結(jié)果凝集結(jié)果推斷標(biāo)準(zhǔn)：①凝集推斷標(biāo)準(zhǔn)：紅細(xì)胞呈均勻分布，無(wú)凝集顆粒，顯微鏡下準(zhǔn)：有助于A、B亞型，類(lèi)B抗原的覺(jué)察，在低倍鏡下凝集程度強(qiáng)弱推斷標(biāo)準(zhǔn)如下。呈一片或幾片凝塊，僅有少數(shù)單個(gè)游離紅細(xì)胞為4。呈數(shù)個(gè)大顆粒狀凝塊，有少數(shù)單個(gè)游離紅細(xì)胞為3。數(shù)個(gè)小凝集顆粒和一局部微細(xì)凝集顆粒，游離紅細(xì)胞約占1/2為2。肉眼可見(jiàn)很多細(xì)沙狀小凝集顆粒，四周有較多的游離紅細(xì)胞，于鏡下觀看，每個(gè)凝集團(tuán)中有5-8個(gè)以上紅細(xì)胞凝集為＋。可見(jiàn)數(shù)個(gè)紅細(xì)胞凝集在一起，四周有很多的游離紅細(xì)胞〔士?？梢?jiàn)極少數(shù)紅細(xì)胞凝集，而大多數(shù)紅細(xì)胞仍呈分散分布為混合凝集外觀〔 mixedfield，MF)。鏡下未見(jiàn)細(xì)胞凝集，紅細(xì)胞均勻分布為〔一。1。表1 ABO血型正反定型結(jié)果判定正定型 被檢者血型 反定型抗BA型紅細(xì)胞B型紅細(xì)胞O型紅細(xì)胞十一A一＋一一十B十一一一一O十＋一十十AB一一一〔二〕試管法標(biāo)記試管取小試管2支，分別標(biāo)記抗A、抗Bo加標(biāo)準(zhǔn)抗血清分別加人抗A、抗B1滴于相應(yīng)標(biāo)記的試管中。51滴于各試管中，混勻，1OOOr/minlmino觀看結(jié)果先觀看上層液有無(wú)溶血現(xiàn)象，再斜持試管輕輕搖動(dòng)或輕輕彈動(dòng)，使管底凝集，必需將反響物倒于玻片上，再以低倍鏡觀看。推斷結(jié)果推斷標(biāo)準(zhǔn)：①凝集推斷標(biāo)準(zhǔn)：完全凝集的管，上層液體清亮、無(wú)色，底部有紅細(xì)胞凝塊，管內(nèi)幕胞呈花邊狀，輕彈試管凝塊不散開(kāi)。完全不凝的管，上層液體清亮、無(wú)色，血細(xì)胞均勻地沉到管底，邊緣整齊，用手指輕彈試管，紅細(xì)胞像一縷煙似的馬上上升，隨即成為均勻的懸液。②凝集強(qiáng)弱程度：推斷標(biāo)準(zhǔn)與玻片法全都。1。【留意事項(xiàng)】嚴(yán)格標(biāo)記，搖動(dòng)玻片動(dòng)作要輕。所用器材必需枯燥清潔、防止溶血；為避開(kāi)穿插污染，試管、尖滴管均一次性使用。標(biāo)準(zhǔn)血清的質(zhì)量、性能要符合要求。標(biāo)準(zhǔn)血清從冰箱取出待其平衡至室溫后再用，用畢后應(yīng)盡快放回冰箱保存，削減細(xì)菌污染時(shí)機(jī)。操作應(yīng)按規(guī)定的程序進(jìn)展，一般先加血清，然后再加紅細(xì)胞懸液，以便核實(shí)是否漏加血清。玻片法定型時(shí)，留意防止懸液枯槁，否則易將玻片邊緣枯槁引起的紅細(xì)胞凝集誤認(rèn)為抗原抗體反響凝集。IgM抗A和抗B4現(xiàn)象的干擾，一般在室溫〔20-24℃〕內(nèi)進(jìn)展試驗(yàn)，37℃可使反響減弱。觀看結(jié)果時(shí)應(yīng)留意紅細(xì)胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝集以及緡錢(qián)狀形成的區(qū)分，明確凝集和溶血的意義是一樣的。登記結(jié)果及發(fā)報(bào)告時(shí)應(yīng)認(rèn)真記錄、嚴(yán)格核對(duì)、避開(kāi)筆誤。幼兒紅細(xì)胞抗原未發(fā)育完全、老年體弱者抗原性較弱，最好承受試管法鑒定血型。斷血型。亞型紅細(xì)胞〔如A3型〕的抗原性較弱，有時(shí)會(huì)消滅混合外觀現(xiàn)象〔即凝集與不凝集細(xì)胞相混合的現(xiàn)象，甚至與較低效價(jià)的抗體血清不消滅凝集反響〔如Ax,Am，要加用AB標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)展鑒定。BB標(biāo)準(zhǔn)血清消滅凝集假象。②嚴(yán)峻的細(xì)菌感染，可激活正常存在于紅TT反響，使紅細(xì)胞消滅全凝集現(xiàn)象。③血清中存在病理性冷凝集素與紅細(xì)胞上抗原結(jié)合，干擾紅細(xì)胞ABO系統(tǒng)的血型鑒定。④局部高球蛋白和特別高球蛋白血癥患者〔如慢性肝病、多發(fā)性骨髓瘤，紅細(xì)胞血型鑒定可消滅困難。在血型鑒定過(guò)程中如遇上述狀況，必需加做自身血清、紅細(xì)胞比照，自身紅細(xì)胞、生理的血型鑒定等家系調(diào)查分析來(lái)進(jìn)展綜合推斷。時(shí)可能消滅混合凝集外觀現(xiàn)象?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】玻片法定型簡(jiǎn)便，不需要離心，適用于大規(guī)模血型普查。該法僅靠抗原抗體的力氣反定型和穿插配血。試管法定型反響快，所需時(shí)間短，適用于急診定型；通過(guò)離心作用增加凝集，可覺(jué)察亞型和較弱的抗原抗體反響，結(jié)果準(zhǔn)確牢靠，為正定型常規(guī)使用方法?！举|(zhì)量把握】更換抗血清批號(hào)或?qū)υ囼?yàn)結(jié)果有疑心時(shí)可設(shè)陽(yáng)性、陰性比照。應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)展試驗(yàn)。紅細(xì)胞懸液濃度過(guò)高或過(guò)低，抗原抗體比例不適當(dāng)，使反響不明顯，簡(jiǎn)潔誤判為陰性反響。玻片法反響時(shí)間不能少于10min,否則較弱凝集不能消滅，造成假陰性。離心時(shí)間和速度應(yīng)準(zhǔn)確，以防止消滅假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。分型血清效價(jià)太低、親和力不強(qiáng)。如抗A血清效價(jià)不高，可將A亞型誤定為O型，AB型誤定為B型。正反定型結(jié)果全都才可發(fā)報(bào)告。標(biāo)記、操作、結(jié)果推斷、結(jié)果記錄與報(bào)告應(yīng)認(rèn)真核對(duì)。二、反定型法【目的】通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞與被檢血清反響，把握用鹽水介質(zhì)法進(jìn)展ABO系統(tǒng)反定型的根本操作方法及結(jié)果推斷，并驗(yàn)證正定型結(jié)果的準(zhǔn)確性?！驹怼坑脴?biāo)準(zhǔn)A、B、O型紅細(xì)胞與被檢血清反響，假設(shè)被檢血清與型別的標(biāo)清與型別的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞不消滅凝集抗體，以此反證被檢者紅細(xì)胞上抗原的型別。【器材】小試管、尖滴管、離心機(jī)、顯微鏡、記號(hào)筆?！驹噭?％A、B、O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞生理鹽水懸液。【標(biāo)本】靜脈血。【操作】分別血清將待檢血液以2500r/min3min,分別血清。標(biāo)記并加被檢者血清取小試管3A、B、O字樣，于各管加人被檢2滴。加標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞按標(biāo)記分別參與5％的A、B、O1滴，1OOOr/minlmin。觀看結(jié)果先觀看上層液有無(wú)溶血現(xiàn)象，再斜持試管輕輕搖動(dòng)或輕輕彈動(dòng)，肉眼觀看有無(wú)凝集，再用低倍鏡觀看。推斷結(jié)果凝集結(jié)果推斷標(biāo)準(zhǔn)：同正定型法。(2〕1?！玖粢馐马?xiàng)】3名安康人同型穎紅細(xì)胞混合，用生理鹽水洗滌3次，以除去存在于血清中的抗體及可溶性抗原。觀看結(jié)果時(shí)假設(shè)試管中消滅溶血現(xiàn)象，說(shuō)明存在抗原抗體反響并有補(bǔ)體激活，應(yīng)視為凝集。先天性免疫球蛋白缺陷，長(zhǎng)期大量應(yīng)用免疫抑制劑，血型抗體可減弱或消逝，造成反定型困難。血清中存在自身免疫性抗體、冷凝集素效價(jià)增高、多發(fā)性骨髓瘤、免疫球蛋白特別均可造成反定型困難。由于生兒體內(nèi)可存在母親輸送的血型抗體，而且自身血型抗體效價(jià)又低，因而誕生6個(gè)月以?xún)?nèi)的嬰兒不宜做反定型。其他與正定型一樣。型通常用試管離心法。【質(zhì)量把握】每批測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)的抗、抗B及抗A＋抗B血清作比照。老年人血清中抗體水平大幅度下降或被檢者血清中缺乏抗A及〔或〕抗B抗體，可引起假陰性或血型鑒定錯(cuò)誤。正、反定型血型結(jié)果不全都時(shí)不能報(bào)告結(jié)果。其他與正定型一樣。試驗(yàn)二 Rh(D)定型【器材】小試管、尖滴管、載玻片〔或有凹槽的玻璃板〕或白瓷板、離心機(jī)、記號(hào)筆、蠟筆、顯微鏡。【試劑】IgM/IgG混合型抗D血清，生理鹽水。【標(biāo)本】外周血或靜脈血?！静僮鳌?％被檢紅細(xì)胞生理鹽水懸液制備：抗凝血離心或紅細(xì)胞自然沉降后取下層紅細(xì)胞2滴于小試管中，加人生理鹽水2ml，用尖滴管將紅細(xì)胞與生理鹽水充分混勻，2500r/min3min3119滴生5％的紅細(xì)胞生理鹽水懸液?！惨弧晨焖僭囼?yàn)該試驗(yàn)最好在外表溫度為20℃—37℃的觀看箱上進(jìn)展。1滴試劑。1滴等體積全血，混勻。輕搖玻片，觀看凝集結(jié)果，判讀結(jié)果應(yīng)在2分鐘內(nèi)進(jìn)展，否則會(huì)由于樣本干固而引起假陽(yáng)性?！捕吃嚬芊ㄓ玫葷B鹽水配制3%-5%待檢紅細(xì)胞懸液。11滴全血或紅細(xì)胞懸液?！?〕1000rpm〔150g〕23000rpm〔1000g〕20秒。輕輕振蕩，懸浮沉積細(xì)胞，觀看凝集結(jié)果。假設(shè)反響為陰性、弱陽(yáng)性或可疑，2015〔6〕1000rpm〔150g〕23000rpm〔1000g〕20秒?！?〕輕輕振蕩，懸浮沉積細(xì)胞，觀看結(jié)果。最終，假設(shè)使用血清克隆抗-D20℃孵育后，反響仍為陰性，那么就需要檢測(cè)弱D原或不完全D使用血清克隆抗-D〔混合型〕重復(fù)上面操作，然后按下述方法連續(xù)試驗(yàn)。弱D抗原

試驗(yàn)：〔8〕3715-303次，最終一次洗滌后，完全倒掉鹽水上清。2滴抗人球蛋白試劑于細(xì)胞中?！?1〕3000rpm〔1000g〕20秒。輕輕振蕩，懸浮沉積細(xì)胞，觀看凝集結(jié)果。DD抗原。該試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)做陽(yáng)性，陰性比照試驗(yàn)。推斷結(jié)果如陽(yáng)性比照管消滅分散，陰性比照管不凝集，再看被檢管，假設(shè)被檢管消滅凝集，為Rh陽(yáng)性，假設(shè)被檢管不凝集，則為Rh陰性?！举|(zhì)量把握】每批測(cè)定確定要做陰性和陽(yáng)性比照，只有在陽(yáng)性比照管消滅凝集而陰性比照管不凝集的狀況下，才能說(shuō)明被檢管的結(jié)果是牢靠的。如結(jié)果為陰性，說(shuō)明被檢紅細(xì)胞上無(wú)相應(yīng)抗原，但由于Du抗原性弱，如被檢者無(wú)凝集，還應(yīng)進(jìn)一步檢查以排解Du的可能。試驗(yàn)三 穿插配血試驗(yàn)一、鹽水介質(zhì)配血法【目的】把握鹽水介質(zhì)穿插配血的根本原理、方法和留意事項(xiàng)?！驹怼孔匀籌gM類(lèi)血型抗體與對(duì)應(yīng)紅細(xì)胞抗原相互作用，在室溫下的鹽水介質(zhì)中之間有無(wú)凝集現(xiàn)象，推斷供血、受血者之間有無(wú)ABO血型不合的狀況?！酒鞑摹啃≡嚬堋⒓獾喂?、離心機(jī)、顯微鏡、記號(hào)筆。【試劑】生理鹽水?！緲?biāo)本】靜脈血。【操作】1．患者標(biāo)本預(yù)備〔1〕分別血清，標(biāo)記為PS(patientserum)。5％患者紅細(xì)胞生理鹽水懸液，標(biāo)記為PC(patientcell)。2．獻(xiàn)血員標(biāo)本預(yù)備〔1〕分別血清，標(biāo)記為DS(donorserum)。(2)5％獻(xiàn)血員紅細(xì)胞生理鹽水懸液，標(biāo)記為DC(donorcell)。穿插配血〔1個(gè)供血者為例〕2支，分別標(biāo)明主、次，即主側(cè)配血管和次側(cè)配血管。在主側(cè)配血管中分別加PS2滴，DC1滴，在次側(cè)配血管分別加DS2滴，PC1滴，混勻，1OOOr/minlmin。觀看結(jié)果先觀看試管上層液有無(wú)溶血，再斜持試管輕輕搖動(dòng)或輕輕彈動(dòng)，觀看管底反響物有無(wú)凝集〔必要時(shí)用顯微鏡觀看。推斷結(jié)果凝集結(jié)果推斷：①凝集結(jié)果推斷標(biāo)準(zhǔn)同正定型試管法。②凝集強(qiáng)弱程度推斷標(biāo)準(zhǔn)同正定型玻片法。配血是否相合推斷標(biāo)準(zhǔn)：①ABO主、次側(cè)任何一管發(fā)生溶血或凝集，暫不行輸血，需查明緣由。②異型配血時(shí)〔指O型血輸人給AB型，或B型輸給AB型可以輸人少量血。如主側(cè)、次側(cè)均無(wú)凝集或主側(cè)凝集，需查找緣由，暫不能輸血。【留意事項(xiàng)】嚴(yán)格三查三對(duì)，確保標(biāo)本、姓名、血型準(zhǔn)確無(wú)誤。觀看到試管內(nèi)溶血現(xiàn)象表示配血不合，說(shuō)明有抗原抗體反響，同時(shí)還有補(bǔ)體參與，必需高度重視。如主側(cè)配血管凝集，應(yīng)制止輸血，必需查找緣由，另選血源。室溫把握在〔22士2〕℃，以防止冷抗體引起凝集反響，影響配血結(jié)果的推斷。鹽水配血相合但有反復(fù)輸血史或妊娠史的受血者，應(yīng)加用聚凝胺介質(zhì)、酶介質(zhì)或抗球蛋白介質(zhì)配血。為確保輸血安全，應(yīng)輸同型血，特別狀況下無(wú)同型血又必需輸血時(shí)，可選擇O型血AB、ABA、BAB型的患者，但主側(cè)管必需無(wú)凝集和溶血現(xiàn)象，次側(cè)有凝集但無(wú)溶血，方允許少量輸入〔200m，但供血者血清中抗A(B)1：64。二、聚凝胺介質(zhì)配血法【目的】把握聚凝胺介質(zhì)穿插配血的根本原理、方法和留意事項(xiàng)?！瞤olybren枸櫞酸鈉而中和，使正常紅細(xì)胞的聚攏解散，而抗體引起的凝集仍存在?！酒鞑摹啃≡嚬?、尖滴管、離心機(jī)、記號(hào)筆、顯微鏡。(lowionstrengthsolu-tion,LISS液。②聚凝胺液(polybrene)。③解聚液即重懸浮液(resupensionsolution)?！緲?biāo)本】靜脈血。【操作】1．患者標(biāo)本預(yù)備〔1〕分別血清，標(biāo)記為PS。(2)5％患者紅細(xì)胞生理鹽水懸液，標(biāo)記為PC。2．獻(xiàn)血員標(biāo)本預(yù)備分別血清，標(biāo)記為DS。配制5％獻(xiàn)血員紅細(xì)胞生理鹽水懸液，標(biāo)記為DC。穿插配血〔1個(gè)供血者為例〕2支，分別標(biāo)明主、次，即主側(cè)配血管和PS和DC1DS和PC各1滴，混勻，1OOOr/minlmin。LISSLISS0.6m1(12滴，混勻后再加聚凝胺2,15s后以1OOOr/min離心lmin棄上清液，觀看管底紅細(xì)胞凝集狀況，假設(shè)各試管中的反響物全部消滅凝集，說(shuō)明試劑有效。2滴，混勻lmin1OOOr/minlmin。在低倍鏡下觀看有無(wú)凝集。推斷結(jié)果凝集結(jié)果推斷：①凝集結(jié)果推斷標(biāo)準(zhǔn)同正定型試管法。②凝集強(qiáng)弱推斷標(biāo)準(zhǔn)同正定型玻片法。配血相合推斷標(biāo)準(zhǔn)：同鹽水介質(zhì)穿插配血法?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】穿插配血有自動(dòng)化儀器法及手工配血法，成批量配血〔如中心血站〕多使用自動(dòng)化〔微柱凝胺試驗(yàn)是利用葡聚糖凝膠具有分子篩效礙而停留在凝膠微柱的上部或凝膠中，則證明發(fā)生凝集反響，可判為凝集反響陽(yáng)性；反之，全部紅細(xì)胞停留在凝膠柱底部，證明未發(fā)生凝集反響，則可推斷凝集反響陰性。該法具有：①檢測(cè)工程齊全、應(yīng)用廣〔包括常規(guī)血型檢查，特別血型檢查、穿插配血、抗體篩檢，直接抗球蛋白及間接抗球蛋白試驗(yàn)等。②靈敏度高，特別在穿插配血時(shí)，能捕獲到格外微弱的差，保障安全翰血，并可實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)治理。缺乏之處是本錢(qián)較昂貴。鹽水介質(zhì)配血法是常用的方法，其操作簡(jiǎn)潔，反響快速，如有血型不合，可馬上顯示出來(lái)?？梢杂X(jué)察臨床上最重要的ABO血型不合，但該法只能覺(jué)察完全抗體，假設(shè)要檢測(cè)不妊娠史和器官移植史的患者不宜承受本法。聚凝胺介質(zhì)配血法可加快凝集反響速度，使原來(lái)在鹽水介質(zhì)中不能凝集紅細(xì)胞的抗體發(fā)生凝集，提高反響靈敏度，能檢測(cè)IgM,IgG等引起溶血性輸血反響的幾乎全部規(guī)章與不規(guī)章抗體，適用于各類(lèi)輸血患者的配血。故該法具有快速、靈敏、結(jié)果牢靠、能檢出完全抗體及不完全抗體等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用，在確定程度上取代了經(jīng)典的抗球蛋白配血法，但操作要求相對(duì)較高。酶介質(zhì)〔木瓜酶或菠蘿蛋白酶〕配血法簡(jiǎn)潔檢出Rh血型抗體，操作較為簡(jiǎn)便，試劑較為簡(jiǎn)潔購(gòu)得，靈敏