第六章基因克隆操作過(guò)程課件

第六章基因克隆操作過(guò)程基因克隆操作過(guò)程概述2023/6/62基因克隆操作過(guò)程VectorTargetgeneRestrictionendonucleaseVectorTargetgene酶切VectorDNAligase連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增篩選2023/6/6基因克隆操作過(guò)程3目的基因的體外重組——酶切和連接（切、接）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）2023/6/6基因克隆操作過(guò)程4本章主要內(nèi)容目的基因的體外重組——切與接重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增——轉(zhuǎn)與增目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢教學(xué)目的及要求理解基因工程各操作步驟的原理。掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。重點(diǎn)：目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選方法。應(yīng)用：能夠根據(jù)一定的研究目的，確定基因克隆的策略，并設(shè)計(jì)其技術(shù)路線。一、目的基因的體外重組——切與接2023/6/65基因克隆操作過(guò)程InvitroRecombinationofTargetGene——DigestionandLigation1.Digestionbyrestrictionendonuclease（切）2023/6/66基因克隆操作過(guò)程目的獲得線性化目的基因片段、線性化載體作用對(duì)象目的基因片段、載體工具：限制性核酸內(nèi)切酶TargetgeneVectorEcoRIPvuII

2023/6/67基因克隆操作過(guò)程PstI2023/6/68基因克隆操作過(guò)程各種限制酶酶切反應(yīng)所使用的buffer（Takara）雙酶聯(lián)合酶切所使用的buffer（Takara）單酶切實(shí)例2023/6/69基因克隆操作過(guò)程雙酶聯(lián)合酶切實(shí)例2023/6/610基因克隆操作過(guò)程2.LigationbyDNAligase（接）2023/6/611基因克隆操作過(guò)程目的獲得含有目的基因的重組分子作用對(duì)象線性目的基因片段、線性化載體工具：

DNA連接酶Vector5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGEcoRI退火T4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向（1）單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接2023/6/612基因克隆操作過(guò)程同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產(chǎn)生的末端相同，同尾酶之間的識(shí)別序列可以相同也可以不同。基因工程中識(shí)別序列不同的同尾酶的應(yīng)用性最大。

（2）同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接Takara網(wǎng)站提供的同尾酶信息2023/6/613基因克隆操作過(guò)程5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCAT5'

TGATCAACTAGT5'

GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGTBclIBamHI退火T4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向目的產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)位置的序列不再是原來(lái)的酶切位點(diǎn)2023/6/614基因克隆操作過(guò)程5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAGGACGTC5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

3'

切平5'

CG5'

GC補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGCCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC（3）不同粘性末端的連接PstIBamHIT4-DNApolymeraseKlenowT4-DNAligase獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物需要鑒定目的基因的連接方向；2023/6/615基因克隆操作過(guò)程目的產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)位置的序列不再是原來(lái)的酶切位點(diǎn)（4）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接CTGCAGNNNNNNNNNGGATCCGACGTCNNNNNNNNNCCTAGGCTGCAGATCCGGPstIBamHIPstIBamHIGGATCCCTGCAGCCTAGGGACGTCGATCCCTGCAGG退火CTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGGT4-DNAligaseCTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGG連接產(chǎn)物中目的基因的方向是確定的2023/6/616基因克隆操作過(guò)程5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCG5'

5'5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGKlenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平TdTdGTPTdTdCTP退火T4-DNAligase（5）人工粘性末端的連接：5’突出末端EcoRIBamHIBamHIBamHI2023/6/617基因克隆操作過(guò)程獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGGCATGCCCCCC3'CC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火KlenowT4-DNAligase（6）人工粘性末端的連接：3’突出末端獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物SphIPstIPstIPstI2023/6/618基因克隆操作過(guò)程5'

G3'C5'C3'GGTTTTTTTTTT3'CC3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAACC3'

GGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGGTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGTTdTdTTPTdTdATP退火T4-DNAligase加熱S1nuclease（5）平末端的連接2023/6/619基因克隆操作過(guò)程5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseGATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'BamHIKlenow補(bǔ)平（6）粘性末端的更換GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinkerGGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRI2023/6/620基因克隆操作過(guò)程DNAligase介導(dǎo)的體外連接實(shí)例2023/6/621基因克隆操作過(guò)程3.重組率重組率：指在基因重組實(shí)驗(yàn)中，獲得的有目的基因的重組分子數(shù)的數(shù)目，占載體分子總數(shù)的百分比。在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：防止載體自連堿性磷酸單酯酶CIP、BAP2023/6/622基因克隆操作過(guò)程CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGGCATGCCCCCC3'CC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火KlenowT4-DNAligase提高重組率的方法加裝同聚尾末端2023/6/623基因克隆操作過(guò)程二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增——轉(zhuǎn)與增2023/6/624基因克隆操作過(guò)程1.轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)（1）Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化原理：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立。其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。處于感受態(tài)的細(xì)菌，容易接受外源DNA。2023/6/625基因克隆操作過(guò)程2023/6/6基因克隆操作過(guò)程《分子克隆第三版》OD600=0.4左右26基因克隆操作過(guò)程2023/6/6《分子克隆第三版》27Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)轉(zhuǎn)化所用DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；熱擊過(guò)程中不要搖晃離心管；檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的Amp抗性時(shí)，轉(zhuǎn)化子鋪平板時(shí)密度應(yīng)低一些（104菌落/板）；轉(zhuǎn)化子于37℃培養(yǎng)不要超過(guò)20小時(shí)。因?yàn)殇伆暹^(guò)密或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)久會(huì)導(dǎo)致平板上出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。轉(zhuǎn)化過(guò)程中37℃溫育菌體使細(xì)菌復(fù)蘇時(shí)的轉(zhuǎn)速不可過(guò)高，為得到較高的轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)使轉(zhuǎn)速小于225rpm。當(dāng)用于涂板的轉(zhuǎn)化液過(guò)多時(shí)，應(yīng)離心濃縮（4100rpm，5min），并用適量SOC液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后涂板。剛進(jìn)行完轉(zhuǎn)化的菌體比較脆弱，涂板時(shí)應(yīng)輕輕涂布。2023/6/628基因克隆操作過(guò)程提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度

不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600來(lái)控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。2023/6/629基因克隆操作過(guò)程試劑的質(zhì)量

所用的試劑，如CaCl2

等均需是最高純度的，并用超純水配制（過(guò)濾除菌，非高壓滅菌），最好分裝保存于干燥的冷暗處（冰箱4℃）。防止雜菌和雜DNA的污染

整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行,所用器皿如離心管、槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選和鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。

2023/6/630基因克隆操作過(guò)程（2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化適用對(duì)象：革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等），其接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常去除細(xì)胞壁后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這與酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞等類似。細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同。以鏈霉菌為例，細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水、無(wú)去污劑。細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：由PEG和Ca2+介導(dǎo)細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素。2023/6/631基因克隆操作過(guò)程（3）λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5。吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘。轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選。2023/6/632基因克隆操作過(guò)程（4）電穿孔轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。特點(diǎn)：電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。2023/6/633基因克隆操作過(guò)程（5）酵母的轉(zhuǎn)化一般有以下兩種方法：利用酵母的原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化（6）植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其他基因轉(zhuǎn)移方法葉盤法電擊法

基因槍法

（7）哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因?qū)敕姿徕}沉淀法脂質(zhì)體載體法顯微注射法DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

2023/6/634基因克隆操作過(guò)程2.轉(zhuǎn)化率（1）轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，能夠接納DNA的受體細(xì)胞數(shù)目，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)）。2023/6/635基因克隆操作過(guò)程例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108

，意味著每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4×1011個(gè)分子，也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子中才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。另一方面，在實(shí)際操作過(guò)程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2mL感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2×1010

個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說(shuō)，每200個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA。。2023/6/636基因克隆操作過(guò)程（2）轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/μg載體，經(jīng)切、接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？（1）若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：104/（107/μgX10-2）=0.1μg載體DNA（2）考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：0.1/20%=0.5μg載體DNA（3）載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5μg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選。2023/6/637基因克隆操作過(guò)程（3）轉(zhuǎn)化率的影響因素載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。插入片段的大小：對(duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。受體細(xì)胞：受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高。供體、受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個(gè)原生質(zhì)體50ngDNA轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化：106-107/μgDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：105-106/μgDNAλ-DNA轉(zhuǎn)染：107-108/μgDNA

電穿孔轉(zhuǎn)化：106-109/μgDNA2023/6/638基因克隆操作過(guò)程3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增（1）擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，37℃培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過(guò)程；λ噬菌體轉(zhuǎn)染后，30℃培養(yǎng)10min等，均屬擴(kuò)增操作。（2）擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞；擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因；表達(dá)外源基因，以便于篩選和鑒定。2023/6/639基因克隆操作過(guò)程三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定——檢由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。2023/6/640基因克隆操作過(guò)程1.載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)（1）抗藥性篩選法將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)非轉(zhuǎn)化子呈Ampr、Tcr轉(zhuǎn)化子呈Ampr、Tcs2023/6/641基因克隆操作過(guò)程Ap抗藥性篩選法的基本操作先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Amp的平板；再將Amp平板上的菌落影印至含有Amp和Tc的平板上；在Amp平板上生長(zhǎng)、但在Amp和Tc平板上不長(zhǎng)的菌落即為轉(zhuǎn)化子。

挑選影印

Ap+Tc2023/6/642基因克隆操作過(guò)程（2）營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組分的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組分，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組分的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子。

常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記用于大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因，常選用色氨酸生物合成基因trp；用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因，常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型。 2023/6/643基因克隆操作過(guò)程（3）顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選。大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ′基因（編碼β半乳糖苷酶，藍(lán)色反應(yīng)）鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（編碼酪氨酸酶，黑色反應(yīng)）

2023/6/644基因克隆操作過(guò)程顯色篩選法的基本操作將外源基因克隆在pUC18的lacZ′標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)轉(zhuǎn)化子為Ampr、lacZ-，呈淡黃色或白色菌落。而非轉(zhuǎn)化子則為Ampr、lacZ+，呈藍(lán)色菌落——藍(lán)白斑篩選。IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷,是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物2023/6/645基因克隆操作過(guò)程2.克隆DNA序列檢測(cè)（1）限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，從而有效地鑒定轉(zhuǎn)化子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。2023/6/646基因克隆操作過(guò)程用BamHI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒DNA，電泳觀察酶解產(chǎn)物片段。轉(zhuǎn)化子：2.7kb+4.0kb非轉(zhuǎn)化子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線性化，然后通過(guò)其長(zhǎng)度來(lái)鑒定其是否為轉(zhuǎn)化子。2023/6/647基因克隆操作過(guò)程用EcoRI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒DNA

轉(zhuǎn)化子：3.0kb+3.7kb

或1