第四章 蛋白質(zhì)的折疊的熱力學與動力學

第四章蛋白質(zhì)的折疊的熱力學與動力學第1頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四一、熱力學和動力學基礎(chǔ)熱力學研究熱現(xiàn)象中物質(zhì)系統(tǒng)在平衡時的性質(zhì)和建立能量的平衡關(guān)系，以及狀態(tài)發(fā)生變化時系統(tǒng)與外界相互作用的學科。動力學基礎(chǔ)研究作用于物體的力與物體運動的關(guān)系第2頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四世界處于永恒的運動變化之中：地殼： 滄海桑田人生： 生老病死植物： 花開花落氣象： 風雨雷電萬事萬物變化的規(guī)律是什么？第3頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四

一切自然界的過程是有方向性的

如：

熱的傳遞：總是從高溫物體自動傳向低溫物體，直至平衡（即溫度均一）。

氣體的流動：從高壓處自動流向低壓處，直至各處壓強相等。

電流：總是從高電勢自發(fā)的流向低電勢處，直至各處的電勢相等，等等。

第4頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四熱力學第一定律即能量守恒定律宇宙的能量是一個常數(shù)，能量可以不斷被轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，但不可能被創(chuàng)造，也不可能被消滅1.熱力學第一定律第5頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四熱力學第二定律人們曾試圖用熱力學第一定律所建立的狀態(tài)函數(shù)判斷：在一定的條件下，一化學變化或物理變化能否自發(fā)的進行？進行到何種程度？

熱力學第二定律人們曾試圖用熱力學第一定律所建立的狀態(tài)函數(shù)判斷：在一定的條件下，一化學變化或物理變化能否自發(fā)的進行？進行到何種程度？其中比較著名的是湯姆遜—塞羅規(guī)則：在沒有外來能量的干預下，一切化學變化都是朝著放出能量最多的方向進行。即，凡放熱反應能自動進行，而吸熱反應均不能自動進行。第6頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四

然而，更多的研究發(fā)現(xiàn)：有不少吸熱反應也能自動進行。C（s）+H2O（g）==CO（g）+H2（g）是一個吸熱反應，但仍能自動的進行。

熱力學第一定律只能告訴人們一化學反應中的能量效應，卻無法解釋，一定條件下，一個化學反應能否自動進行及進行到何種程度。也即無法解決化學變化的方向和限度問題。第7頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四2.熱力學第二定律的經(jīng)典表述1.克勞修斯：不可能將熱從低溫物體轉(zhuǎn)到高溫物體，而不引起其它的變化。2．開爾文：不可能從單一的熱源取出熱使之完全轉(zhuǎn)化為功，而不發(fā)生其它的變化。第8頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四熱力學將不能做功的隨機和無序狀態(tài)的能定義為熵，以S表示宇宙或系統(tǒng)的各種過程總向著熵增大的方向進行2.1熱力學第二定律之熵判據(jù)第9頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四在孤立體系或絕熱體系中系統(tǒng)一切可以發(fā)生的過程要么是熵變?yōu)?（可逆，平衡態(tài)），要么熵變大于0（不可逆）。熵不可能減小，即熵總是增大的。

第10頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四熱力學將系統(tǒng)中總的熱量稱為焓，以H表示在恒定溫度和壓力條件下總能量中可以做功的那一部分能量為自由能，以G表示DG=DH-TDS(T為絕對溫度)因此，當熵增加時，系統(tǒng)的自由能便會下降2.2熱力學第二定律之自由能判據(jù)第11頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四

在一個反應中，如果產(chǎn)物比反應物含有更少的自由能，這個反應便趨向于自發(fā)地進行第12頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四物理和化學過程達到平衡時，即達到系統(tǒng)的自由能最小而熵最大第13頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四二、蛋白質(zhì)折疊的熱力學定律熵判據(jù)和蛋白質(zhì)折疊自由能判據(jù)和蛋白質(zhì)折疊蛋白質(zhì)折疊的熱力學假說第14頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四1.熵判據(jù)和蛋白質(zhì)折疊未折疊的狀態(tài)包含很多具有不同構(gòu)象的分子。第15頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第16頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四疏水作用是熵驅(qū)動的自發(fā)過程當疏水化合物或基團進入水中，它周圍的水分子將排列成剛性的有序結(jié)構(gòu)，即形成所謂籠形結(jié)構(gòu)，最常見的就是五角形十二面體籠形結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)比冰更為有序。但當疏水作用發(fā)生時，籠型結(jié)構(gòu)被破壞，這部分水分子被排入自由水中，使得體系的混亂度增加，即熵值增加。同時，疏水基團的聚集是有序化的過程，熵值減少，但其變化值不大，一般對蛋白質(zhì)折疊不起主要作用。第17頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四疏水作用是多肽鏈折疊的主要驅(qū)動力，疏水作用的主要動力來自于蛋白質(zhì)溶液體系的熵值的增加。疏水作用是熵驅(qū)動的自發(fā)過程第18頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四2.吉布斯自由能判據(jù)和蛋白質(zhì)折疊ΔG=ΔH-TΔS第19頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四吉布斯自由能變化應同時考慮多肽鏈和溶劑兩者對體系焓值變化和熵值變化的貢獻

ΔG總=ΔH鏈+ΔH溶劑-TΔS鏈-TΔS溶劑折疊態(tài)蛋白質(zhì)與伸展態(tài)相比,是一種高度有序化的結(jié)構(gòu),因此ΔS鏈是負數(shù),則-TΔS鏈為正值。ΔH鏈對疏水側(cè)鏈為正值,從而有利于伸展態(tài)。第20頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四ΔH溶劑對疏水側(cè)鏈是負值,有利于折疊態(tài)。這是因為蛋白質(zhì)處于折疊態(tài)時,許多水分子之間的相互作用將代替水分子和疏水側(cè)鏈的相互作用。ΔH鏈與ΔH溶劑值都不大,一般對折疊不起主要作用。蛋白質(zhì)折疊過程中會打破水的有序化,則ΔS溶劑為較大的正值,因而有利于折疊態(tài)。對于典型的蛋白質(zhì)來說,對折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性做出單項最大貢獻的是疏水殘基引起的ΔS溶劑。在不同類型的蛋白質(zhì)中,總熵變化和總焓變化所做的貢獻是不同的,但結(jié)果一樣,蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)是生理條件下自由能最低的構(gòu)象。因此,從吉布斯自由能的變化值來考慮,多肽鏈的折疊是熱力學中的自發(fā)過程第21頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四3.“熱力學假說”天然蛋白質(zhì)多肽采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下熱力學上最穩(wěn)定的構(gòu)象，采取天然構(gòu)象的多肽鏈和它所處的一定環(huán)境條件（如溶液組分、pH、溫度、離子強度等）整個系統(tǒng)的自由能最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈在一定的環(huán)境條件下能夠自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。第22頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第23頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四三、蛋白質(zhì)折疊的動力學TheLevinthalParadox中間體動力學假說第24頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四1.TheLevinthalParadox當?shù)鞍渍郫B是構(gòu)象搜索時，將會有太多的構(gòu)象需要嘗試。僅僅考慮蛋白的主鏈，每個殘基在未折疊時假設(shè)只有3個構(gòu)象，對一個有100AA的多肽來說將有3100

構(gòu)象。如果構(gòu)象搜索的速度是1012

構(gòu)象/s，需要5x1035s(1.6x1028y)蛋白質(zhì)折疊不是隨機的，而是有捷徑的。第25頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四2.中間體在蛋白質(zhì)從變性態(tài)折疊成天然態(tài)的過程中，通常要經(jīng)歷若干個中間的分子構(gòu)象狀態(tài)，即蛋白折疊中間體，也叫做部分折疊態(tài)。它們通常具有部分天然蛋白的結(jié)構(gòu)，相對分子量相同，是分子構(gòu)象不同的同一種蛋白質(zhì)。第26頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四熔球態(tài)(meltonglobule)

熔球態(tài)是折疊的中間體，快速步驟，在折疊途徑中第一個可觀測的、柔性無序的未折疊多肽鏈卷折成局部有組織的球狀態(tài)，稱為熔球體。熔球體的形成的驅(qū)動力：疏水側(cè)鏈的包埋第27頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四分子伴侶和折疊酶幫助越過能障第28頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四折疊能量“地貌”原理圖未折疊的蛋白具有高的構(gòu)象熵和高的能量。折疊過程中漏斗變窄表示構(gòu)象的種類下降。兩邊的低洼處表示半穩(wěn)定的中間體，這些中間體可以減慢折疊過程。底部表示所有的中間體都到達了天然結(jié)構(gòu)。第29頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四有人提出若某一多肽鏈具有2種低能量狀態(tài)：一種是天然構(gòu)象，一種是非天然構(gòu)象，而且處于這2種能量狀態(tài)的多肽鏈的相互轉(zhuǎn)變由于要克服較高的能壘而難以實現(xiàn)，那么在蛋白折疊過程中會有2種途徑相互競爭，一種是正確折疊成天然構(gòu)象的途徑，另一種是錯誤折疊成穩(wěn)定的非天然構(gòu)象途徑。第30頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四1型人胰島素生長因子實驗存在2種穩(wěn)定構(gòu)象天然構(gòu)象錯配二硫鍵的非天然構(gòu)象多肽鏈具相似自由能但二級結(jié)構(gòu)成分不同第31頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四3.“動力學假說”90年代輔助蛋白(Accessory

protein)的發(fā)現(xiàn)——細胞內(nèi)新生肽段的折疊一般意義上說是需要幫助的，而不是自發(fā)進行的。幫助蛋白質(zhì)折疊的生物大分子主要是分子伴侶和折疊酶。不僅僅受“熱力學”控制，也受到“動力學”的控制。第32頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第33頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四Therulesgoverningproteinfoldingarecomplex熱力學動力學特殊蛋白？？？被列為“21世紀的生物物理學”的重要課題第34頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四四、折疊機制的理論模型1框架模型（FrameworkModel）

框架模型假設(shè)蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象依賴于局部的氨基酸序列。在多肽鏈折疊過程的起始階段,先迅速形成不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)單元；隨后這些二級結(jié)構(gòu)靠近接觸,從而形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)框架；最后，二級結(jié)構(gòu)框架相互拼接，肽鏈逐漸緊縮，形成了蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。這個模型認為即使是一個小分子的蛋白也可以一部分一部分的進行折疊,其間形成的亞結(jié)構(gòu)域是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu)。第35頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四2.疏水塌縮模型（HydrophobicCollapseModel）

在疏水塌縮模型中，疏水作用力被認為是在蛋白質(zhì)折疊過程中起決定性作用的力的因素。在形成任何二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之前首先發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮。——疏水內(nèi)核包埋

折疊機制的理論模型

第36頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四3.擴散-碰撞-粘合機制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）

該模型認為蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個位點，在這些位點上生成不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)單元或者疏水簇，主要依靠局部序列的近程或中程（3-4個殘基）相互作用來維系。它們以非特異性布朗運動的方式擴散、碰撞、相互黏附，導致大的結(jié)構(gòu)生成并因此而增加了穩(wěn)定性。進一步的碰撞形成具有疏水核心和二級結(jié)構(gòu)的類熔球態(tài)中間體的球狀結(jié)構(gòu)。球形中間體調(diào)整為致密的、無活性的類似天然結(jié)構(gòu)的高度有序熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。最后無活性的高度有序熔球態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾挠谢盍Φ奶烊粦B(tài)。折疊機制的理論模型

第37頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四4.成核-凝聚-生長模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）

根據(jù)這種模型，肽鏈中的某一區(qū)域可以形成“折疊晶核”，以它們?yōu)楹诵?，整個肽鏈繼續(xù)折疊進而獲得天然構(gòu)象。所謂“晶核”實際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限速步驟。折疊機制的理論模型

第38頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四5.拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）

此模型的中心思想就是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進行折疊,在沿每條途徑折疊的過程中都是天然結(jié)構(gòu)越來越多,最終都能形成天然構(gòu)象,而且沿每條途徑的折疊速度都較快,與單一途徑折疊方式相比,多肽鏈速度較快,另一方面,外界生理生化環(huán)境的微小變化或突變等因素可能會給單一折疊途徑造成較大的影響，而對具有多條途徑的折疊方式而言,這些變化可能給某條折疊途徑帶來影響,但不會影響另外的折疊途徑,因而不會從總體上干擾多肽鏈的折疊,除非這些因素造成的變化太大以致于從根本上影響多肽鏈的折疊。折疊機制的理論模型

第39頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四五、蛋白質(zhì)折疊研究意義生物工程應用認識與折疊有關(guān)的疾病蛋白質(zhì)分子設(shè)計。。。。。。第40頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四六、蛋白質(zhì)折疊研究意義解決異源表達不能正確折疊形成包涵體這一生物工程中的瓶頸問題。對蛋白質(zhì)錯誤折疊引起的折疊病—在醫(yī)學上不僅開辟了與分子伴侶和應激蛋白有關(guān)的新的研究領(lǐng)域，也開創(chuàng)了廣闊的應用前景。開辟蛋白設(shè)計的新領(lǐng)域—自然界不存在的全新的、具有某些特定性質(zhì)的蛋白質(zhì)。第41頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四目前生物制藥大多采用大腸桿菌作為宿主細胞

效率高、產(chǎn)量大周期短、成本低工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控

缺點是易形成包含體第42頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌表達的重組蛋白易形成包含體

高效表達的目的蛋白在大腸桿菌內(nèi)形成大量無活性包含體。因無法有效的解決復性問題，在美國每年造成的經(jīng)濟損失就達幾十億美元

包含體電鏡圖第43頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四1、生物工程應用“瓶頸”問題：在簡單的微生物細胞內(nèi)引入異體DNA后所合成的多肽鏈往往不能正確折疊成為有生物活性的蛋白質(zhì)而形成不溶解的包含體或被降解。這一“瓶頸”問題的徹底解決有待于對新生肽鏈折疊更多的認識。第44頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四體外分子伴侶的實際應用★分子伴侶GroEL相當于無活性蛋白的親合配基；★利用固定化小分子伴侶對體外無活性蛋白進行復性；★利用人工合成分子伴侶。第45頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四2.與折疊有關(guān)的疾病(“構(gòu)象病”)“分子病”:由于基因突變造成蛋白質(zhì)分子中僅僅一個氨基酸殘基的變化就引起疾病的情況，如地中海鐮刀狀紅血球貧血癥“折疊病”:蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒有改變，只是其結(jié)構(gòu)或者說構(gòu)象有所改變引起的疾病。由于蛋白質(zhì)折疊異常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常轉(zhuǎn)運到位第46頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四常見“折疊病”老年性癡呆癥(Alzheimersyndrome)病人腦中充滿了由錯誤折疊蛋白形成的雜亂的蛋白質(zhì)簇。主要分為兩類：含有沉淀樣β蛋白（Aβ

）的沉淀樣斑，tau蛋白引起的神經(jīng)細胞內(nèi)自損傷。帕金森氏癥（Parkinsondisease）主要是由于蛋白質(zhì)的錯誤折疊，病人隨意運動的控制能力逐漸喪失，因為能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞逐步被破壞，其原因和發(fā)生機制尚不清楚。某些腫瘤抑癌基因突變造成抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變引起的一些癌癥的發(fā)生。p53穩(wěn)定性的降低導致癌癥的發(fā)生。第47頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四Whatcausesmadcow?盶蛋白－PRIONStanleyB.PPrusiner，1997，NobelPrice第48頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四 DefinitionofPrion第49頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第50頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第51頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四Prion的研究TheNobelAssemblyhasawardedtheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinefor1997toStanleyB.Prusiner,forhisdiscoveryof"prions-anewbiologicalprincipleofinfection".第52頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四Prion致病機制Prion疾病起始于正常的PrPC發(fā)生錯誤折疊，形成富含β-折疊結(jié)構(gòu)的、抗蛋白酶水解的PrPSc，錯誤折疊的PrPSc有很強的聚集傾向，先形成淀粉樣的小纖維，成為形成淀粉樣斑塊的前體，進一步聚合形成淀粉樣斑塊，最后發(fā)展為可被臨床診斷的大腦海綿狀退化變性病癥。第53頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第54頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第55頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四成核-多聚化模型

PrPC和PrPSc處于熱力學平衡，而PrPSc單體不穩(wěn)定，聚集在一起后變得穩(wěn)定。PrPSc聚集體通過結(jié)合PrPSc單體促進PrPC的轉(zhuǎn)化，使平衡向生成致病型構(gòu)象的方向移動。在這個過程中具有傳染性的物質(zhì)是PrPSc的多聚體，限速步驟是形成作為種子進一步穩(wěn)定的PrPSc的核。PrPC如何轉(zhuǎn)變成PrPSc？

第57頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四模板輔助轉(zhuǎn)化模型

PrPSc在熱力學上比PrPC更穩(wěn)定，但PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc時要克服能壘。在沒有PrPSc存在時，PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc的速度很慢；在PrPSc存在時，它與PrPC的結(jié)合降低了轉(zhuǎn)變所需的活化能，使PrPSc迅速增長。PrPC如何轉(zhuǎn)變成PrPSc？

第58頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第59頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第60頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四第61頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四4、蛋白質(zhì)設(shè)計▲DNA重組和多肽合成技術(shù)的發(fā)展使我們能夠按照自己的意愿設(shè)計較長的多肽鏈。但由于我們無法了解這一多肽將折疊為何種構(gòu)象，從而無法按照自己意愿設(shè)計我們需要的、具有特定功能的蛋白質(zhì)?！鴮τ诘鞍踪|(zhì)相互作用、配體與蛋白質(zhì)的作用等結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究也有賴于蛋白質(zhì)折疊機制的闡明。第62頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四六、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性第63頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四1.研究意義和支撐技術(shù)意義為研究蛋白質(zhì)的熱力學定律提供理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)醫(yī)藥、食品工程產(chǎn)業(yè)有巨大的應用前景支撐技術(shù)差異掃描量熱法定點突變第64頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四2.定義蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是指作用力的凈余額，它決定著一個蛋白是處于天然構(gòu)象還是處于變性狀態(tài)。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性主要指蛋白質(zhì)的物理上（熱力學）的穩(wěn)定性，而不是化學穩(wěn)定性。第65頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四化學穩(wěn)定性化學穩(wěn)定性主要指由于鍵的斷裂而使結(jié)構(gòu)的完整性喪失天冬酰胺和谷胺酰胺的去氨基化低pH值下精氨酸的水解高溫下蛋氨酸的氧化二硫鍵的斷裂中性pH值下二硫鍵的交換硫醇催化的二硫鍵的交換或者半胱氨酸殘基的氧化第66頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四3.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性即天然和變性狀態(tài)下自由能的差。DG=GN-GU=-RTlnK天然態(tài)下自由能（GN

）的減少和變性態(tài)下自由能（GU

）的增加都會導致DG的減小K=[N]/[U]=FN/(1-FN)第67頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性單體蛋白折疊的穩(wěn)定性一般在5-10kcal/molDG=GN-GU=-RTlnK K=e-DG/RT=e-10x1000/(2x298)=2x107室溫下液體溶液中折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)和非折疊的蛋白質(zhì)的比例是2x107:1!第68頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性K作為一個平衡常數(shù)，蛋白折疊的速度常數(shù)（kf）和蛋白去折疊的速度常數(shù)（ku）之比。K=kf/ku如果一個蛋白自發(fā)折疊的速度常數(shù)是1s-1（kf=1s-1

），那么這個蛋白自發(fā)去折疊的速度常數(shù)大約為10-7s-1，半衰期大約為0.693/10-7s=80days表明去折疊的蛋白只是瞬間存在的研究去折疊態(tài)就需要用urea,pH,etc等來打破平衡第69頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四4.打破折疊平衡的方法極端pH使蛋白變性變性劑溫度變性第70頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四4.1極端pH使蛋白變性高pH或者低pH可以使大部分蛋白變性大量離子進入蛋白質(zhì)的內(nèi)部而出現(xiàn)斥力減弱了疏水作用進而導致蛋白質(zhì)的部分去折疊。特異離子鍵的出現(xiàn)導致蛋白質(zhì)處于一些緊密的中間態(tài)如熔球態(tài)。第71頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四4.2變性劑蛋白質(zhì)在變性劑溶液中的穩(wěn)定性：SCN-<Cl-<Urea<SO42-RNase:GuSCN=0.3M,GuHCl=0.8M,urea=3M打破疏水相互作用和氫鍵（支鏈和主鏈）第72頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四4.3溫度變性溫度對蛋白結(jié)構(gòu)的影響可以分為兩種，熱變性和冷失活。溫度變性主要影響是破壞氫鍵和增加疏水性。第73頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四5.研究穩(wěn)定性的方法一切可以區(qū)別折疊和去折疊狀態(tài)的方法光吸收(e.g.Trp,Tyr)CDNMRDSC尿素梯度電泳–

通過F和U狀態(tài)下遷移率的改變催化活性第74頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四6.支撐技術(shù)差異掃描量熱法定點突變第75頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四熱容量

系統(tǒng)在某一過程中，溫度升高（或降低）1℃所吸收（或放出）的熱量叫做這個系統(tǒng)在這個過程中的“熱容量”。熱容量與溫度變化有關(guān)，還與體系的狀態(tài)轉(zhuǎn)變有關(guān)，因此也與蛋白質(zhì)折疊和去折疊相關(guān)。非折疊態(tài)的熱容量要比折疊態(tài)的蛋白質(zhì)的熱容量要大。

Cp=H/T=TS/T天然態(tài)和非天然態(tài)中水有序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變導致了蛋白質(zhì)熱容量的改變。

第76頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四6.1差示掃描量熱法

量熱實驗：以恒定的速率加熱兩個量熱池，一個量熱池裝蛋白質(zhì)溶液，另一個量熱池裝緩沖液作對照，為了保持兩個量熱池的溫度相等分別加熱，它們熱量需求的差別就是兩個池中熱容量的差別。差示掃描量熱法(differentialscanningcalorimetry;DSC)是一種熱分析法。在程序控制溫度下，測量輸入到試樣和參比物的功率差（如以熱的形式）與溫度的關(guān)系。差示掃描量熱儀記錄到的曲線稱DSC曲線，可以測定多種熱力學和動力學參數(shù)。

第77頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四差異掃描量熱法(DSC)DSCmeasurestheheatrequiredtoraisethetemperatureofthesolutionofmacromoleculesrelativetothatrequiredtothebufferalone.DSCcanbeusedtodirectlymeasuretheenthalpyandmeltingtemperatureofathermallyinducedtransition. AtTm(50%unfolded),

DG=0,DH=TDS第78頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四Van‘tHoff焓DG=GN-GU=-RTlnKDG=DH-TDS-RTlnK=DH-TDSlnK=(-DH/R)(1/T)+DS/Ry=mx+bVan‘tHoff曲線(lnKvs.1/T)可以從平衡常數(shù)隨溫度的變化關(guān)系中得到蛋白質(zhì)熱變性的Van‘tHoff焓。

第79頁，共88頁，2023年，2月20日，星期四發(fā)現(xiàn)中間體與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的焓有兩個：通過平衡常數(shù)算得的Van‘tHoff焓，DHVH通過量熱法獲得的量熱焓，DHcal如果DHVH

＝DHcal

，表明在Tm處沒有中間體的存在,系統(tǒng)屬于兩態(tài)轉(zhuǎn)變對于大部分兩態(tài)轉(zhuǎn)變的蛋白來說

DHVH