整個基因克隆實驗流程完整

260280260260280260一、

組

織

總

RNA

的

提

取相關試：T；氯仿；苯酚；異丙醇；乙醇；RNase-free相關儀：冰機；液氮&研缽生物樣品研磨儀；高速離心機；移液器（1ml、μl、100lμl）；渦旋振蕩儀；溫金屬浴。相關耗：剖工具，冰盒，離心管，離心管架，吸頭（200lμl），一次性手套，實驗手套。實驗步驟1.取暫養(yǎng)草魚，冰上放置一段時間，然后解剖，剪取腸道50~100mg，放入研缽中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml預冷TRIzol試劑，充分研磨至無顆粒物存在。2.轉(zhuǎn)移到離心管中，室溫放置使細胞充分裂解；3.按1mlTrizol加入l氯仿，蓋上蓋子，迅速充分搖勻15s，然后室溫放置3min；4.4℃，離心15min；此時混合物分為三層，下層紅色的苯酚氯仿層，中間層和上層無色水相RNA存在于無色水相中；5.小心吸取上清液，千萬不要吸取中間界面，否則有DNA污染；轉(zhuǎn)移至一個新的離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻；6.室溫放置；4℃，離心；7.棄上清，加入1ml醇洗滌；渦旋，懸浮沉淀；4℃，離心；8.棄上清；可以再次用乙醇洗滌沉淀；9.棄上清；用移液器輕輕吸取管壁或管底的殘余乙醇，注意不要吸取沉淀；室溫放置晾干沉淀；（樣品不要過于干燥，否則極難溶解）10.沉淀中加入30lRNase-free水，輕彈管壁，使RNA溶解。RNA質(zhì)量測相關試：酚藍，TEB/TAE電泳緩沖液，溴錠（EB）相關儀：超微量分光光度計，移液器（l或μl規(guī)格，10l規(guī)格），電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，制冰機）相關耗：無菌無絨紙，吸頭，離心管架，管，管架，錐形瓶，燒杯，一次性手套，實驗手套，冰盒）（1）RNA度的檢測：測定其OD和的值，根據(jù)其OD/OD的比值，當其比值在之間，說明提取的總RNA純度比較高，沒有蛋白質(zhì)和基因組的污染。（2RNA完整性的檢測：μ，與2l酚藍混勻，的瓊脂糖進行凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察效果。28S與帶清晰，且亮度比大約是2:1時，帶若隱若現(xiàn)，而且沒有其它條帶時，說明完整性不錯，可以用于下游逆轉(zhuǎn)錄實驗。

222222二、

逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)成cDNA）相關儀：PCR儀恒溫金屬浴，移液器μl或2l規(guī)格10l規(guī)格）100l冰盒，制冰機，PCR管）根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO公司）說明書進行，反應體系及條件如下：試劑使用量（μl）FreeOligo（dT）

1TotalY（）Total65，后，立即置于冰上。試劑使用量（μl）上一步變性后RNA溶液5×RTBufferdNTPMixture（2Inhibitor（10U/lReverTraAceTotal20然后放置于PCR儀上反應程序為：℃,60min99℃,5min16℃所cDNA放置于-℃保存。三、PCR應相關儀：PCR儀恒溫金屬浴，移液器（μl或μl規(guī)格，μl規(guī)格），μl電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機）反應條件：

試劑

使用量（μl）

95,變性；℃變退火30s℃反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物35循環(huán)；10Buffer。dNTP（）反應結(jié)束后，酶1U/l）物瓊脂糖Ghrelin-F（μ測。（10MgCl（）Total10

性30s，55延伸45s，共72延伸取5lPCR產(chǎn)凝膠電泳檢

260022四、260022

PCR物的分，回收和純相關試：回收試劑盒相關儀：紫外照膠儀，移液器（200l，1ml規(guī)格），離心機恒溫金屬浴，渦旋混勻儀，制冰機，超微量分光光度計）相關耗：切膠刀片，吸頭，離心管架）PCR反應得到得于-五、目的片段與載的連接相關儀：恒溫金屬浴，移液器（μl，l規(guī)格）渦旋混勻儀，冰機）盒(TAKARA)pMD-18T1lDNAμlddHμl入μlMix，4/16℃放置過夜連接。六、轉(zhuǎn)化相關儀：超凈工作臺，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫搖床，恒溫金屬浴/水浴鍋，移液器（1000l100l，μlμl格）渦旋混勻儀，制冰機）CaCl法制大腸菌DH5a受態(tài)細胞全過程冰上進行，4℃離心，無菌操作。（1）以接種環(huán)從-℃保存的高效轉(zhuǎn)化菌種蘸取少量菌液劃無抗生素平板，培養(yǎng)12h；（2）挑取單菌落接種于1ml無抗生素LB培養(yǎng)基中，℃劇烈震蕩培養(yǎng)6h；（3）按接種菌液于LB液體培養(yǎng)基中，℃震蕩培養(yǎng)～，至達～；（這一步非常關鍵，培養(yǎng)過度的菌液含有較多的“老”細胞，制備成感受態(tài)細胞后其接受外援DNA的能力較低，從而導致轉(zhuǎn)化率降低）（4）冰上預冷；然后4，離心；（6）棄上清，將細菌沉淀重新懸浮于冷的中，冰?。?）4℃，6000rpm離心，棄盡上清；（8液體積的5%冷的CaCl溶液重懸細菌沉淀時加入預冷的甘油（甘油終濃度達15～20%，混勻后按每支μl在冰上分裝。-80℃保存?zhèn)溆?。連接產(chǎn)物化到感受態(tài)胞（1）將10l連接產(chǎn)物加100l感受態(tài)菌液中，冰上放置30min；（2）然后放到42℃水浴鍋中熱激90s，再冰上放置（3）加890lLB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)60min；（4）每個培養(yǎng)平板中加入μ和μlIPTG然后吸取100l菌液，均勻涂布于含AmpLB固體培養(yǎng)基平板上；（537℃培養(yǎng)箱中正放待菌液被瓊脂完全吸干后倒置平板過夜培養(yǎng)培養(yǎng)時間不宜過長，否則有衛(wèi)星菌落產(chǎn)生）七、菌液PCR檢測相關儀（儀/恒溫金屬浴渦旋混勻儀移液（規(guī)格1000l格100l電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機）

22在平板上挑取10～個白色菌落含有Amp+LB液體培養(yǎng)基的離心管中，37震蕩培養(yǎng)6h3000rpm離心后吸掉上層μl清液短暫渦旋將沉淀打散，然后把菌液當成模板按上面方法進行擴增經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有目的條帶。挑選擴增出正確目的條帶的菌液送公司測序。22附注：主要溶液和培養(yǎng)基的配制1）電泳緩液10×TBE：108gTris堿55g硼酸，的，加入蒸餾水混勻后定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH為；2）LB體培養(yǎng)基：蛋白胨，酵母提取物，NaCl；加去離子水，用10M節(jié)pH，定容至1000ml，高壓（×）滅菌4℃保存；3固體培養(yǎng)基LB液培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為溫滅菌后降溫至50~60℃，在無菌狀態(tài)下鋪制平，室溫放置過夜后，置于℃保存；4）氨芐青素貯存液：用無菌雙蒸水配成100mg/ml，分裝，℃保存。使用時終濃度為100ug/ml。5用于制備感受態(tài)細胞的CaCl（稱取0.56g（無水分析純?nèi)芙庥?0ml雙蒸水中，定容至，高壓滅菌；6）（20mg/ml）的配制：將20mgX-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，℃避光保存；7）IPTG（）的配制：將溶1ml離子雙蒸水中，濾膜除菌，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

17172221717222RACE（dT）-接頭引物：5GACATCGA(T)3接頭引物：5GAGTCGACATCG31.cDNA的合成OligodT接頭引物

μl1lTotalμl65立即置于冰上。第一步變性后的RNA溶液μl5×RTBuffer4ldNTP（各2l（40U/lμlReverTraAceμl總體積

20l反應條件：42,60min99℃16℃,5min。2.cDNA的純化利用膠回收試劑盒進行（去除多余的和引物）。最后使用μlTE洗脫沉淀。3.第一輪PCRcDNA1l10Buffer1ldNTP（10mmol/LOligodT接頭引物(μ3RACE外引物(10Taq酶1U/l)MgCl（）

μlμlμlμlμlddHOμl反應條件：降落。PCR產(chǎn)物稀釋10作為模板進行下游實驗。4.第二輪PCRcDNA1l10BufferμldNTP（10mmol/L接頭引物(μ3RACE內(nèi)引物(10Taq酶1U/l)MgCl（）反應條件：降落。

μlμlμlμlμlμl

222222RACE1.cDNA的合成基因特異性反義引物

μl1lTotalμl65立即置于冰上。第一步變性后的RNA溶液μl5×RTBuffer4ldNTP（各μl（40U/lμlReverTraAce1l總體積

20l反應條件：42,60min99℃16℃,5min。2.cDNA的純化利用膠回收試劑盒進行（去除多余的和引物）。最后使用μlTE洗脫沉淀。3.cDNA的加尾純化后的cDNA5×末端轉(zhuǎn)酶緩沖液

μl2lμl末端轉(zhuǎn)移酶（30U/l）μl總體積

10l反應條件：℃；70℃。反應結(jié)束，cDNA釋1倍作模板進行下游實驗。4.第一輪PCRcDNA1l10Buffer1ldNTP（10m