β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座

β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物山東省藥品檢驗(yàn)所張雷β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第1頁一.高分子聚合物研究（一）β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物定義與分類1.定義藥品中高分子聚合物系指藥品中分子量大于藥品本身雜質(zhì)總稱。其分子量普通在1000～5000，個(gè)別可至10000道爾頓左右。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第2頁2.起源與分類β-內(nèi)酰胺類抗生素藥品中高分子雜質(zhì)按其起源可分為兩類：外源性雜質(zhì)與內(nèi)源性雜質(zhì)。2.1外源性雜質(zhì)：普通起源于發(fā)酵工藝，為蛋白、多肽、多糖等雜質(zhì)或與抗生素結(jié)合雜質(zhì)。如：青霉素中青霉噻唑蛋白，青霉噻唑多肽。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第3頁2.2內(nèi)源性雜質(zhì)：系指抗生素藥品本身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來自生產(chǎn)過程，又可在儲(chǔ)存過程中形成；甚至在用藥時(shí)也能夠產(chǎn)生，如阿莫西林顆粒。伴隨當(dāng)代生產(chǎn)工藝不停改進(jìn)和提升，當(dāng)前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨降低，故對(duì)內(nèi)源性聚合物控制是當(dāng)前抗生素藥品高分子雜質(zhì)控制重點(diǎn)。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第4頁（二）β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征β-內(nèi)酰胺類抗生素主要包含青霉素和頭孢菌素兩大類。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第5頁β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第6頁除青霉素G和V外,臨床中慣用β-內(nèi)酰胺類抗生素均為半合成抗生素,故除青霉素G和V中還含有少許青霉噻唑蛋白外,其它制劑中高分子雜質(zhì)主要是聚合物。1.

青霉噻唑蛋白，多肽制劑中青霉噻唑蛋白，多肽分子量主要分布在2400～3500，由青霉素β-內(nèi)酰胺環(huán)和多肽上伯氨基按親核反應(yīng)機(jī)理縮合而成，主要在發(fā)酵工藝中形成，高pH環(huán)境有利于縮合反應(yīng)進(jìn)行；樣品在儲(chǔ)存過程中，多肽類雜質(zhì)殘留自由氨基仍能和β-內(nèi)酰胺環(huán)反應(yīng)，直至飽和。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第7頁1.

青霉素聚合物青霉素聚合反應(yīng)可按兩種方式進(jìn)行：（1）

反應(yīng)僅和母核結(jié)構(gòu)相關(guān)，側(cè)鏈中活性基團(tuán)不參加反應(yīng)。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第8頁（1）

側(cè)鏈參加聚合反應(yīng)主要以氨芐青霉素為代表，反應(yīng)時(shí)側(cè)鏈氨基親核攻擊β-內(nèi)酰胺抗生素羰基碳原子，形成聚合物。

β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第9頁1.

頭孢菌素聚合反應(yīng)也包含兩種類型：只依賴于母核N型聚合反應(yīng)和側(cè)鏈參加L型聚合反應(yīng)。對(duì)于7位側(cè)鏈中不含有自由氨基頭孢菌素只能發(fā)生N型聚合反應(yīng)。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第10頁(三)β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量和過敏反應(yīng)關(guān)系引發(fā)過敏反應(yīng)過敏原a.

分子量大b.

含有一定抗原決定簇青霉素過敏反應(yīng)中主要抗原決定簇——青霉噻唑基（BPO）頭孢菌素過敏反應(yīng)中主要抗原決定簇——7位R1側(cè)鏈c.

多價(jià)β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第11頁β-內(nèi)酰胺類抗生素本身并不是過敏原，而只有當(dāng)它們與蛋白、多肽、多糖等大分子載體共價(jià)結(jié)合成全抗原或本身聚合成多價(jià)半抗原后才能引發(fā)過敏反應(yīng)。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第12頁（四）.影響聚合物形成原因1.

青霉素聚合物青霉素聚合物反應(yīng)速度在液體條件下和溶液酸堿度關(guān)系親密；在固體條件下主要和樣品水分含量相關(guān)。2.

頭孢菌素聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度關(guān)系親密，試驗(yàn)表明，貯存溫度較低時(shí)，含水量差異堆聚合物含量盡管有影響，但影響不大。但當(dāng)貯存溫度上升至37攝氏度時(shí)含水量差異對(duì)聚合物含量影響十分顯著。3.工藝不一樣如氨芐青霉素有溶媒結(jié)晶和噴霧干燥兩種，普通后者聚合物要顯著多于前者。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第13頁（五）.口服青霉素類藥品使用前進(jìn)行皮試必要性口服青霉素，如青霉素V鉀與其它注射用青霉素一樣能夠形成高分子聚合物，其聚合速度與藥品濃度、反應(yīng)溫度及pH等相關(guān)。制備青霉素V聚合物豚鼠皮膚被動(dòng)過敏試驗(yàn)（PCA）陽性，口服青霉素V高聚物后，30分鐘血清中可檢出高聚物；在30分鐘到1小時(shí)可引發(fā)豚鼠PCA反應(yīng)陽性，從而證實(shí)青霉素中高分子聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過敏反應(yīng)。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第14頁二.高分子雜質(zhì)分析方法（一）概述：國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多分離、分析β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)報(bào)道。色譜法是主要分離分析方法。其分離模式有三類：（1）反相模式（2）離子交換模式（3）凝膠色譜模式因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)不一樣高分子雜質(zhì)通常有相同生物學(xué)特征，所以，在藥品質(zhì)量控制中普通不需分別控制不一樣結(jié)構(gòu)高分子雜質(zhì)含量，而只需控制商品中高分子雜質(zhì)總量。故依據(jù)分子量差異進(jìn)行分離凝膠色譜模式是簡(jiǎn)便易行分離模式。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第15頁（一）凝膠色譜分析法原理：1.

分離原理利用凝膠色譜分子篩機(jī)制，讓藥品分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)被排阻不能進(jìn)入，在色譜過程中不被保留，最早被流動(dòng)相洗脫。2.

凝膠介質(zhì)依據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素和其高分子雜質(zhì)分子量特點(diǎn)，比較數(shù)種凝膠介質(zhì)，最終選取SephadexG-10作為凝膠介質(zhì)（排阻分子量在1000道爾頓左右）。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第16頁（一）分析方法1.

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為確保不一樣試驗(yàn)室間測(cè)定精密度符合要求，要求方法系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)：理論板數(shù)及拖尾因子：用藍(lán)色葡聚糖溶液（1mg/ml）作為參比溶液，測(cè)定在流動(dòng)相A、B中Kav＝0保留時(shí)間，并計(jì)算出理論板數(shù)及拖尾因子。在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖峰保留時(shí)間比值應(yīng)在0.93～1.07之間，對(duì)照溶液主峰與供試品溶液中聚合物峰與對(duì)應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖峰保留時(shí)間比值應(yīng)為0.93～1.07。藥品分子和凝膠介質(zhì)間相互作用和藥品結(jié)構(gòu)相關(guān)。其色譜分析受色譜條件如：流動(dòng)相組成、濃度、pH、流速等原因影響。所以可經(jīng)過改變色譜調(diào)整調(diào)整藥品分子和凝膠介質(zhì)間相互作用，使高分子雜質(zhì)和藥品分子間分離良好，經(jīng)過對(duì)流動(dòng)相與洗脫速度優(yōu)化，已成功建立數(shù)十種β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)分析方法。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第17頁2.

本身對(duì)照外標(biāo)法因?yàn)棣?內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)含有高度不均一性和不確定性，高聚物本身不穩(wěn)定，不易制備。用高聚物本身作為對(duì)照外標(biāo)法定量有一定難度。同時(shí)因?yàn)楦叻肿与s質(zhì)含量較低，進(jìn)樣量普通相對(duì)較大，是藥品本身色譜峰十分寬大，造成主峰峰面積積分誤差較大，所以也限制了面積歸一化法應(yīng)用。試驗(yàn)證實(shí)，在特定條件下，β-內(nèi)酰胺抗生素可締合形成表觀分子量較大締和物，締和物在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)種色譜行為與高分子雜質(zhì)一樣，都在Kav＝0處表現(xiàn)為單一色譜峰，利用這一特點(diǎn)，在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)種制訂了新定量方法——本身對(duì)照外標(biāo)法。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第18頁三．β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物法增修訂概況β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第19頁（一）.修訂內(nèi)容1.

對(duì)原收載8個(gè)品種色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)均與新增品種項(xiàng)下書寫格式相同。2.

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：統(tǒng)一為理論板數(shù)以藍(lán)色葡聚糖峰計(jì)算均不低于…。拖尾因子均應(yīng)小于2.0，在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖峰保留時(shí)間比值均應(yīng)在0.93～1.07之間；對(duì)照溶液主峰與供試品溶液中聚合物峰與對(duì)應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖峰保留時(shí)間比值均應(yīng)在0.93～1.07。3.

對(duì)照品溶液修改為對(duì)照溶液4.

頭孢他啶聚合物項(xiàng)下，流動(dòng)相A由原來含3.5％硫酸銨pH7.00.01M磷酸鹽緩沖液修訂為含3.5％硫酸銨pH7.00.1M磷酸鹽緩沖液。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第20頁四.操作關(guān)鍵點(diǎn)(一).色譜條件中流動(dòng)相A組成與濃度，pH值及流速對(duì)測(cè)定結(jié)果影響。1.

流動(dòng)相組成與濃度：本方法流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液。用不一樣濃度磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相時(shí)，藥品分子色譜行為隨其濃度增加，主峰保留時(shí)間也隨之增大。2.

流動(dòng)相pH值對(duì)聚合物檢出影響：相同濃度，pH不一樣，樣品分離情況也不一樣，如阿莫西林在pH7.00.05M磷酸鹽緩沖液分析時(shí)無聚合物峰檢出，而改用pH8.00.05M磷酸鹽緩沖液則分離良好。3.

流速：調(diào)整流速可改變色譜峰保留時(shí)間，已到達(dá)最正確分離效果。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第21頁（二）.相關(guān)對(duì)照溶液測(cè)定幾個(gè)注意點(diǎn)試驗(yàn)證實(shí)，β-內(nèi)酰胺類抗生素在特定條件下，如水，0.01％SDS或0.5％葡萄糖溶液作為流動(dòng)相B，可締合成表觀分子量極大締和物，其色譜行為與高分子雜質(zhì)一樣，都在Kav＝0流出，表現(xiàn)為單一色譜峰，利用這一特點(diǎn)，作為測(cè)定方法中新定量法——本身對(duì)照外標(biāo)法。但因?yàn)棣?內(nèi)酰胺類抗生素品種繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，故在研究制訂各品種方法課時(shí)，出現(xiàn)以下幾個(gè)問題：β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第22頁1.

相關(guān)對(duì)照溶液保留時(shí)間與藍(lán)色葡聚糖峰保留時(shí)間不一致問題。如頭孢拉定，可能SephedexG-10對(duì)頭孢拉定有一定吸附作用引發(fā)，能夠經(jīng)過用0.2M氫氧化鈉和0.5M氯化鈉溶液約350ml沖洗凝膠柱，然后用水沖洗至中性，使凝膠柱活化，改進(jìn)保留時(shí)間不一致情況。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第23頁1.

標(biāo)準(zhǔn)中系統(tǒng)適用性試驗(yàn)項(xiàng)下要求：取對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于5.0%。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，青霉素鈉，頭孢曲松鈉，頭孢呋辛鈉等大部分品種均能符合要求，且五次統(tǒng)計(jì)色譜圖峰重現(xiàn)性好，但阿莫西林連續(xù)五次進(jìn)樣，峰高逐步降低，而峰寬逐步增加，色譜柱用上述方法處理活化后略有改進(jìn)，但仍不可能道道五個(gè)峰重合。以上現(xiàn)象可能與阿莫西林分子結(jié)構(gòu)相關(guān)?？紤]阿莫西林為青霉素半合成產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)中有與青霉素相同母核，而其分子量也較靠近，而青霉素在水中締合物穩(wěn)定，重現(xiàn)性好故決定用青霉素作為對(duì)照品，并加校正因子計(jì)算結(jié)果。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第24頁

β-內(nèi)酰胺類個(gè)別品種在特定條件下出現(xiàn)不能完全締合現(xiàn)象。如硫酸頭孢噻利，硫酸頭孢匹羅。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第25頁（三）.樣品測(cè)定幾個(gè)注意點(diǎn)1.

低聚物對(duì)高聚物分離度影響。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第26頁1.

試驗(yàn)結(jié)果積分處理凝膠色譜結(jié)果特殊性a.

色譜峰不能到達(dá)基線分離b.

色譜峰對(duì)稱性較差或拖尾嚴(yán)重上述情況帶來數(shù)據(jù)處理復(fù)雜性，難以調(diào)整峰寬、斜率等參數(shù)得到合理積分值。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第27頁（四）.相關(guān)試驗(yàn)技術(shù)1.

凝膠預(yù)處理要求新使用凝膠：充分溶脹室溫20攝氏度需3小時(shí)以上，煮沸需1小時(shí)已使用過凝膠再生：先用0.2MNaOH與0.5MNaCl混合液浸泡半小時(shí)后用水洗至中性，裝柱。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第28頁1.

裝柱關(guān)鍵點(diǎn)a.

凝膠漿濃度應(yīng)適合（普通為70％）水混懸液，分散均勻不結(jié)團(tuán)（不宜強(qiáng)烈攪拌）。b.

防止空氣泡。c.

填充時(shí)應(yīng)盡可能使?jié){液均勻分布，預(yù)防分層與氣泡產(chǎn)生。β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第29頁1.

色譜柱維護(hù)保養(yǎng)a.

葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過高壓力會(huì)損傷填料性能。b.

預(yù)防柱子長(zhǎng)霉可用20％乙醇或0.04％疊氮鈉保留。c.

預(yù)防柱子受污染可用0.2M氫氧化鈉和0.5M氯化鈉混合液沖洗凝膠柱，然后用水沖洗至中性β內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物專家講座第30頁1.

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求（1）

藍(lán)色葡聚糖色譜行為特殊意義a.

保留時(shí)間表示流動(dòng)相流速確定條件下Kav＝0洗脫時(shí)間，即相當(dāng)于被排阻聚合物洗脫保留時(shí)間。b.

該保留時(shí)間與