正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠腸道菌群多態(tài)性分析

西南交通大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）第正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠腸道菌群多態(tài)性分析摘要【目的】設(shè)計(jì)應(yīng)用T-RFLP技術(shù)，對(duì)正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的腸道菌群進(jìn)行多態(tài)性分析；【方法】設(shè)計(jì)一個(gè)引物的5‘末端用熒光物質(zhì)標(biāo)記（常用熒光物質(zhì)有HEX,TET,6-FAM等），使樣本DNA經(jīng)PCR后都帶有這種熒光物質(zhì)；【結(jié)果】PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后酶切，可以先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最后對(duì)酶切后的產(chǎn)物末端進(jìn)行測(cè)序得到了T-RFLP峰譜圖,該圖譜能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)不同種的菌群進(jìn)行定性、定量的分析；【結(jié)論】成功使用T-RFLP技術(shù)對(duì)正常小鼠和IL10基因敲除小鼠的腸道菌群進(jìn)行多態(tài)性分析，得到兩種小鼠腸道菌群的差異性，經(jīng)分析可以得到一種或幾種菌群對(duì)于IL-10有特殊的聯(lián)系。對(duì)于IL-10的應(yīng)用有重要作用。關(guān)鍵詞T-RFLP技術(shù)；基因圖譜；IL-10基因Il-10GENEknockoutmiceandnormalmiceintestinalflorapolymorphismanalysisAbstract【Objective】DesigningapplicationofT-RFLPtechnique,thenormalmiceandIL-10knockoutmiceintestinalflorapolymorphismanalysis.【Methods】Designingaprimer5'terminalmarkedwithfluorescentsubstances(commonlyusedfluorescentsubstancehasaHEX,TET,6-FAM,etc.),aftermakingthesampleDNAbyPCRwiththefluorescentsubstance.【Results】PCRproductafterpurificationoftheenzyme,canfirstcarriesontheagarosegelelectrophoresis,finallyafterenzymedigestionoftheendproductsequencinggotT-RFLPpeakspectra,themapcanrapidlyandaccuratelyfordifferentkindsofmicrobesforqualitativeandquantitativeanalysis.【Conclusion】SuccessfulusingT-RFLPtechniqueofIL-10knockoutmiceandnormalmiceintestinalflorapolymorphismanalysis,getthedifferencesoftwokindsofintestinalflorainmice,bytheanalysisofoneorseveralkindsofbacteriacanbehaveaspecialconnectionfortheIL-10.FortheapplicationofIL-10playanimportantrole.KeywordsT-RFLPtechnique;Genemapping;Il-10gene首先介紹一下IL-10，在1989年，Mosmannand及他們的同事描述了一種新的免疫介質(zhì)，由Th2細(xì)胞克隆分泌，能夠抑制Th1細(xì)胞克隆IL-2和IFNr的合成。早期被命名為細(xì)胞因子合成抑制因子（CSIF），這種因子后來(lái)被命名為IL-10，在這被發(fā)現(xiàn)的21年期間，很多研究深入剖析了這個(gè)細(xì)胞因子的生物學(xué)特性.IL-10的分子量為35～40kd，通常為二聚體；主要由TH2細(xì)胞產(chǎn)生，也可由單核細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及活化的B細(xì)胞產(chǎn)生。IL-10能夠抑制活化的T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，因此曾稱為細(xì)胞因子合成抑制因子（csif），特別是抑制th1細(xì)胞產(chǎn)生il-2、ifnγ和lt等細(xì)胞因子，從而抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-10可降低單核－巨噬細(xì)胞表面mhcⅡ類分子的表達(dá)水平，損害了apc的抗原遞呈能力，實(shí)際上這可能是其抑制細(xì)胞介導(dǎo)免疫的原因。此外，IL-10還能抑制NK細(xì)胞活性，干擾NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子；但可刺激B細(xì)胞分化增殖，促進(jìn)抗體生成。近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析,主要的研究方法包括:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)、熒光原位雜交法(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、變性梯度凝膠電泳法(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)和末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)等[1]。T-RFLP的技術(shù)原理是根據(jù)的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5‘末端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，常用熒光物質(zhì)有HEX,TET,6-FAM等。提取待分析樣的中DNA，以他為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)張，所得到的PCR產(chǎn)物的一段就帶有這種熒光標(biāo)記，然后PCR產(chǎn)物有合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，一般選用酶切位點(diǎn)為4bp的限制性內(nèi)切酶。由于在不同細(xì)菌的擴(kuò)增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點(diǎn)就會(huì)存在差異，酶切后就會(huì)產(chǎn)生很多不同長(zhǎng)度的限制性片段。消化產(chǎn)物用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)定，只有末端帶有熒光性標(biāo)記的片段能被檢測(cè)到。因?yàn)椴煌L(zhǎng)度的末端限制性片段必然代表不同的細(xì)菌，通過(guò)檢測(cè)這些末端標(biāo)記的片段就可以反應(yīng)微生物群落組成情況[2]。這種方法還可以進(jìn)行定量分析，在基因掃描圖譜上，每個(gè)峰面積占總峰面積的百分?jǐn)?shù)代表這個(gè)末端限制性片段的相對(duì)數(shù)量，即末端限制性片段的數(shù)量越大其所對(duì)應(yīng)的面積越大[3]。材料和實(shí)驗(yàn)流程1、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料：正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的糞便以及它們的腸道組織。樣本有兩組,一組樣本有十六個(gè),另一組樣本有八個(gè)。實(shí)驗(yàn)試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，PCR反應(yīng)體系所需試劑DNA聚合酶、dNTP、buffer、上下游引物（自己設(shè)計(jì)，標(biāo)記熒光，交由生工合成），純化試劑盒，酶切反應(yīng)體系所需試劑酶、buffer，DNA電泳液電泳所需試劑瓊脂糖凝膠、電泳液、marker、loading等。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：移液槍，槍頭，PCR儀，金屬浴儀，DNA電泳儀，滅菌鍋，離心機(jī)，振蕩器，PH計(jì)，凈化工作臺(tái)，DNA分析測(cè)序儀（交由生工分析）等。2、實(shí)驗(yàn)流程2.1細(xì)菌基因組DNA提?。ㄐ∈蠹S便基因組提取試劑盒）1）將樣品加到2ml的EP管中；2）加400ulAP1和4ulRNaseA，65℃溫浴10min，每三分鐘顛倒混勻一次（溫浴時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)）；3）加130ulAP2，混勻，冰浴5min，14000rpm5min；4）將上清轉(zhuǎn)移到2ml吸附柱內(nèi)，14000rpm5min；5）將收集管內(nèi)上清移入一個(gè)新的EP管內(nèi)，不可有沉淀，加入1.5倍的AP3，混勻；6）分次將混合液移入一個(gè)新的2ml吸附柱內(nèi)，8000rpm1min，棄掉收集管中液體；7）將吸附柱移入一個(gè)新的收集管內(nèi)，加500ulAW，8000rpm1min，棄掉收集管中液體；8）再加500ulAW，14000rpm2min；9）將吸附柱移入一個(gè)2ml的EP管內(nèi)，加100ul超純水（55℃）洗脫，室溫靜置5min，8000rpm1min，在通風(fēng)處放置1min，再重復(fù)一次效果更佳。2.2引物設(shè)計(jì)上游引物8F(5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′)，在5′末端加上熒光物質(zhì)6-FAM標(biāo)記，下游引物806R(5′-GGACTACCRGGGTATCTAA-3′)，在5′末端用HEX進(jìn)行標(biāo)記[4][5][6]。2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系采用50μL,模板量為2μL,陰性對(duì)照用ddH2O代替模板DNA。PCR擴(kuò)增條件為:94°C5min;94°C30s,52°C30s,72°C2min,共30個(gè)循環(huán);72°C10min。PCR反應(yīng)完成后用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收800bp位置的DNA條帶。2.4限制性內(nèi)切酶酶切選用HhaⅠ作為實(shí)驗(yàn)的限制性內(nèi)切酶。酶切體系采用40μL,PCR產(chǎn)物為6μL,在37°C酶切6h,反應(yīng)完成后,HhaⅠ在65°C水浴中20min失活。2.5瓊脂糖凝膠電泳分析在酶切完全之后，取5ul的酶切液進(jìn)行電泳，140V，30min，看電泳條帶，一般這個(gè)條帶會(huì)很淡，因?yàn)橹鳁l帶被切碎成很多的片段，大小不一，分布的很開，因此我們主要還是看800bp位置的條帶是否還是存在，一般酶切完全之后這個(gè)位置的條帶基本就已經(jīng)沒(méi)有了，其實(shí)在酶切的過(guò)程中就會(huì)進(jìn)行多次電泳來(lái)決定其酶切的時(shí)間和程度，以便于及時(shí)停止酶切反應(yīng)，保證酶切的質(zhì)量。2.6T-RFLP分析的流程圖上面是兩張簡(jiǎn)易的T-RFLP流程圖，可以比較直觀方便了解其實(shí)驗(yàn)的步驟：2.7T-RFLP圖譜預(yù)處理對(duì)于每個(gè)圖譜，去除熒光強(qiáng)度小于100和片段大小≦35或者≥500的片段數(shù)據(jù)，將剩下片段的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并去除相對(duì)豐度小于1％的片段[7][8]。2.8數(shù)據(jù)分析將T-RFLP的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成1～0矩陣（1表示有，0表示無(wú)），利用SPSS16.0中的聚類分析工具（Classifiy-hierarchicalAnalysis），采用非加權(quán)配對(duì)算法平均法對(duì)每組樣本進(jìn)行聚類分析。接下來(lái)用軟件SPSS16.0進(jìn)行物種豐度（S）和Shannon-Weiner指數(shù)（H）的計(jì)算,結(jié)果用圖表顯示。二、結(jié)果用提取的八個(gè)糞便樣本的基因組做PCR，電泳圖如右：八個(gè)樣本的編號(hào)從左到右依次是：P3、21B、23、59A、P1、29、47A、P4前四個(gè)樣本是干預(yù)組的，后四個(gè)是對(duì)照組。每一組四個(gè)樣本的小鼠都是經(jīng)過(guò)相同處理的，通過(guò)電泳圖的觀察來(lái)決定酶切時(shí)所加的PCR產(chǎn)物量的多少，來(lái)保證酶切的DNA量接近，不會(huì)相差太多，導(dǎo)致誤差太大。HhaⅠ酶切充分之后，進(jìn)行DNA分析測(cè)序，得到T-RFLP的圖譜和原始數(shù)據(jù)。圖譜分析：遵循的原則：Anyfragmentof≦35or≥500bpwasexcluded；T-RFscanvaryoverarangeof1~3bpamongdifferentgelsorlanes[9][10].左面是干預(yù)組的兩張圖譜，樣本號(hào)分別是23和P3.《坐標(biāo)表示-（Size，Height）》同一組樣本的圖譜在峰值區(qū)域的存在基本上是一致的，500bp以上的峰值可能是沒(méi)有酶切開或者是酶切不了的片段，不作為參考依據(jù)。峰值的高低差異在一定范圍內(nèi)都是屬于正常的。左面是對(duì)照組的兩張圖譜，樣本編號(hào)分別是P1和59.這兩張圖譜的峰情況基本相同，差異不大。比較對(duì)照組和干預(yù)組的圖譜，不難發(fā)現(xiàn)這兩組之間最大的差異大致就在size95bp~100bp間的峰。接下來(lái)就進(jìn)行具體的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見(jiàn)表格一。表格一：從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中能看到差異較大的有兩個(gè)區(qū)域，size大小分別是92bp~99bp，225bp~369bp。討論人體腸道內(nèi)有1014的細(xì)菌，包括大量的專性厭氧菌。由于傳統(tǒng)方法的局限，有不少的菌是無(wú)法進(jìn)行培養(yǎng)的，因此一般分離培養(yǎng)方法只能分析出人腸道內(nèi)40%左右的細(xì)菌，導(dǎo)致研究的片面性。而基于16srRNA的T－RFLP不需要分離培養(yǎng)過(guò)程，理論上可以檢測(cè)到微生態(tài)系統(tǒng)中所有的菌[11]。IL-10基因的發(fā)現(xiàn)及IL-10細(xì)胞因子在動(dòng)物體中的重要作用越來(lái)越引起大家的注意，特別是其在免疫系統(tǒng)中的作用?，F(xiàn)在有一些病人因?yàn)镮L-10細(xì)胞因子的原因患了一些疾病，因此我們對(duì)IL-10進(jìn)行了研究，我們通過(guò)T-RFLP技術(shù)對(duì)IL-10細(xì)胞因子在腸道菌群中的影響進(jìn)行研究[12]。通過(guò)T-RFLP技術(shù)得到的數(shù)據(jù)，我們可以初步判定IL-10基因?qū)τ谛∈蟮哪c道菌群是有很大影響的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之間腸道菌群存在很大差異，至少有一種或多種菌群在數(shù)量上差異很大[13]。T-RFLP技術(shù)能夠?qū)ξ⑸鷳B(tài)系統(tǒng)進(jìn)行準(zhǔn)確快速的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，擁有易于自動(dòng)化和數(shù)據(jù)共享等優(yōu)勢(shì)[14]。參考文獻(xiàn)：[1]AasJA,BarbutoSM,AlpagotT,OlsenI,DewhirstFE,PasterBJ.(2021).SubgingivalplaquemicrobiotainHIVpositivepatients.JClinPeriodontol34:189–195.[2]AasJA,GriffenAL,DardisSR,LeeAM,OlsenI,DewhirstFEetal.(2021).Bacteriaofdentalcariesinprimaryandpermanentteethinchildrenandyoungadults.JClinMicrobiol46:1407–1417.[3]AasJA,PasterBJ,StokesLN,OlsenI,DewhirstFE.(2021).Definingthenormalbacterialfloraoftheoralcavity.JClinMicrobiol43:5721–5732.[4]BeckerMR,PasterBJ,LeysEJ,MoeschbergerML,KenyonSG,GalvinJLetal.(2021).Molecularanalysisofbacterialspeciesassociatedwithchildhoodcaries.JClinMicrobiol40:1001–1009.[5]ColeJR,ChaiB,FarrisRJ,WangQ,Kulam-Syed-MohideenAS,McGarrellDMetal.(2021).TheRibosomalDatabaseProject(RDP-II):introducingmyRDPspaceandqualitycontrolledpublicdata.NucleicAcidsRes35:D169–D172.[6]CraigRG,BoylanR,YipJ,MijaresD,ImamM,SocranskySSetal.(2021).SerumIgGantibodyresponsetoperiodontalpathogensinminoritypopulations:rela-tionshiptoperiodontaldiseasestatusandprogression.JPeriodontalRes37:132–146.[7]deLilloA,AshleyFP,PalmerRM,MunsonMA,KyriacouL,WeightmanAJetal.(2021).Novelsubgingivalbacterialphylotypesdetectedusingmultipleuniversalpolymerasechainreactionprimersets.OralMicrobiolImmunol21:61–68.[8]DenepitiyaL,Kleinberg[9]DonleyCL,BadovinacR,SapirS,ShapiraL,HouriY,KantarciAetal.(2021).IgGantibodylevelstoPorphyromonasgingivalisandclinicalmeasuresinchildren.JPeriodontol75:221–228.[10]DrayS,DufourAB.(2021).Theade4package:implement-ingthedualitydiagramforecologists.JStatSoftw22:1–20.[11]ForneyLJ,ZhouX,BrownCJ.(2021).Molecularmicrobialecology:landoftheone-eyedking.CurrOpinMicrobiol7:210–220.[12]HaffajeeAD,CuginiMA,TannerA,PollackRP,SmithC,KentJrRLetal.(2021).Subgingivalmicrobiotainhealthy,well-maintainedelderandperiodontitissubjects.JClinPeriodontol25:346–353.[13]HartGT,ShafferDJ,AkileshS,BrownAC,MoranL,RoopenianDCetal.(2021).Quantitativegeneexpres-sionprofilingimplicatesgenesforsusceptibilityandresistancetoalveolarboneloss.InfectImmun72:4471–4479.[14]HooperLV,GordonJI.(2021).Commensalhost–relation-shipsinthegut.Science292:1115–1118.JenkinsonHF,LamontRJ.(2021).Oralmicrobialcommu-nitiesinsicknessandinhealth.TrendsMicrobiol13:589–595.[15].Binder,H.J.;Filburn,B.;Floch,M.Bileacidinhibitionofintestinalanaerobicorganisms.Am.J.Clin.Nutr.1975,28,119–125.[16].Floch,M.H.;Gershengoren,W.;Diamond,S.;Hersh,T.Cholicacidinhibitionofintestinalbacteria.Am.J.Clin.Nutr.1970,23,8–10.[17].Rowland,I.;Faughnan,M.;Hoey,L.;W?h?l?,K.;Williamson,G.;Cassidy,A.Bioavailabilityofphyto-oestrogens.Br.J.Nutr.2021,89(Suppl.1),S45–S58.綜述T-RFLP技術(shù)在腸道菌群研究中的應(yīng)用進(jìn)展［關(guān)鍵詞］多樣性;腸道菌群微生物群落的多樣性一直是微生態(tài)學(xué)和環(huán)境微生物學(xué)研究的重點(diǎn)，在人類疾病的預(yù)防和治療及機(jī)制研究中占據(jù)著舉足輕重的地位。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們不再滿足單純的依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)及鏡檢方法對(duì)微生態(tài)進(jìn)行研究，而越來(lái)越多的是從分子水平的角度去研究復(fù)雜的微生物群落組成及其多樣性。一種以PCR技術(shù)、RFLP技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)產(chǎn)生的準(zhǔn)確、高通量、快速簡(jiǎn)便的對(duì)微生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)的技術(shù)，即末端標(biāo)記的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism，T-RFLP)，成為人們研究各類微生物群落多樣性的工具。通過(guò)對(duì)帶熒光標(biāo)記片段(Terminalrestrictionfragment，T－RF)的大小、峰高和峰面積的分析得到目標(biāo)系統(tǒng)的菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性進(jìn)行分析及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，因此擁有易于自動(dòng)化、數(shù)據(jù)共享等優(yōu)勢(shì)。本文就其在人體腸道微生物菌落分析中的應(yīng)用和展望進(jìn)行闡述。1T－RFLP在人腸道菌群菌落分析的應(yīng)用人體腸道內(nèi)有1014的細(xì)菌，包括大量的專性厭氧菌。由于傳統(tǒng)方法的局限，有不少的菌是無(wú)法進(jìn)行培養(yǎng)的，因此一般分離培養(yǎng)方法只能分析出人腸道內(nèi)40%左右的細(xì)菌，導(dǎo)致研究的片面性。而基于16srRNA的T－RFLP不需要分離培養(yǎng)過(guò)程，理論上可以檢測(cè)到微生態(tài)系統(tǒng)中所有的菌。Nagashima［1］通過(guò)對(duì)8個(gè)正常人糞便的DNAT－RF分布與TAP(T－RFLPanalysisprogram)軟件模擬分析的結(jié)果進(jìn)行比較，得出適合用于檢測(cè)人糞便菌群，尤其是雙歧桿菌的新的引物－酶組合。Mstsumoto等［2］通過(guò)建立種系發(fā)生比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)，印證了該方法可達(dá)到對(duì)人結(jié)腸群落種水平的分析，與TAP數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌種類有80%的匹配度。Li等［3］對(duì)T－RFLP的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)總DNA提取的方法進(jìn)行了摸索，最終得出該技術(shù)具有高通量、高重現(xiàn)性的特點(diǎn)，能很好的反映人類腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征的結(jié)論。Anonia等［4］對(duì)一個(gè)成年人的糞便進(jìn)行分析，得到82個(gè)菌種，其中擬桿菌屬、球形梭菌和柔嫩梭菌亞種占據(jù)了95%。目前，由于數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)資料的缺乏，只有24%的T－RF可以查出對(duì)應(yīng)的菌種，如多形類桿菌、普拉梭桿菌、直腸真桿菌等。1.1T－RFLP在研究各年齡階段人體腸道菌群差異中的應(yīng)用人腸道內(nèi)的菌群處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化中，不同生理階段、不同的環(huán)境等都會(huì)造成菌群結(jié)構(gòu)上的差異，這種動(dòng)態(tài)平衡與人體健康息息相關(guān)。嬰兒糞便內(nèi)的微生物群落保持基本穩(wěn)定，而在斷奶后則發(fā)生顯著改變。Sakata等［5］利用T－RFLP技術(shù)對(duì)嬰兒腸道內(nèi)進(jìn)行群落分析，結(jié)果顯示最初定植的主要是大腸桿菌、擬桿菌、腸球菌、鏈球菌、韋榮球菌屬、葡萄球菌，前兩種菌是嬰兒母乳喂養(yǎng)期間的優(yōu)勢(shì)群落，在斷奶后大腸桿菌的數(shù)量顯著減少，而梭菌屬的數(shù)量明顯增加［6］，結(jié)果還顯示微生物群落的分布特征具有明顯的個(gè)體差異性。在對(duì)不同生活方式的兒童糞便微生態(tài)變化的研究分析中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)歐洲國(guó)家的兒童腸道菌群多樣性與飲食結(jié)構(gòu)有顯著相關(guān)［7］。人腸道菌群會(huì)隨著年齡的增加而發(fā)生相應(yīng)的變化。Hide-nori等［8］對(duì)6名老年人的腸道菌群進(jìn)行了研究，T－RFLP檢測(cè)結(jié)果顯示老年人腸道內(nèi)主要的菌群為擬桿菌、梭桿菌Ⅳ，Ⅸ亞型菌種，梭桿菌ⅪVa亞型菌種和γ－變形菌，其中梭桿菌ⅪVa亞型菌種的數(shù)量比健康成年人的含量低，同時(shí)在健康年輕個(gè)體腸道內(nèi)多見(jiàn)的卵瘤胃球菌在老年人體內(nèi)卻未查見(jiàn)，而γ－變形菌則具有較高的檢出率。Hidenori等［9］對(duì)3個(gè)尸檢個(gè)體的各個(gè)腸段微生物進(jìn)行T－RF分析，發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體不同腸段的微生物菌群結(jié)構(gòu)有著明顯的差異。Layer等［10］使用T－RFLP技術(shù)分析人類糞便中的金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)具有在種水平上鑒定菌種的優(yōu)勢(shì)。隨著T－RFLP分析技術(shù)在人類微生物群落研究中利用的增加，人們將對(duì)自身特別是胃腸道內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)有了更深入的了解，對(duì)很好的利用有益微生物，抑制有害種類及合理的預(yù)防和治療相關(guān)疾病大有裨益。1.2T－RFLP在腸道相關(guān)疾病臨床診治中的研究人體健康是一個(gè)微生態(tài)平衡的問(wèn)題，一旦這種平衡被打破，將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此，檢測(cè)腸道菌群的結(jié)構(gòu)可能會(huì)成為一種有效的輔助診斷指標(biāo)。Wang等［11］發(fā)現(xiàn)18位異位性濕疹患兒腸道菌群T－RF所反映的平均群落峰值和多樣性指數(shù)均顯著低于健康兒。Akira等［12］通過(guò)T－RFLP對(duì)比分析潰瘍性結(jié)腸炎病人及健康個(gè)體的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)病人腸道內(nèi)含有健康個(gè)體沒(méi)有的胃瘤球菌屬、真細(xì)菌、梭菌、γ－變形菌、非典型的擬桿菌和非典型乳桿菌。同時(shí)UC(ulcerativecolitis)活躍期與非活躍期病人的腸道菌群也有差異，胃瘤球菌屬、梭菌和真細(xì)菌的T－RFs主要在活躍期UC病人腸道內(nèi)被檢測(cè)到，而在非活躍期病人腸道內(nèi)主要檢測(cè)到的是乳酸桿菌和非典型乳酸桿菌。在另一研究中，學(xué)者利用T－RFLP分析出早產(chǎn)兒，尤其是濫用過(guò)抗生素的壞死性小腸結(jié)腸炎早產(chǎn)兒腸道菌群的多樣性極為單一，且γ－變形菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)［13］，顯示出該技術(shù)用于多樣性分析中的優(yōu)勢(shì)。有資料提示一些疾病與腸道菌群的失衡息息相關(guān)，而突破傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的T－RFLP技術(shù)更能直觀的反映菌群的失衡。Mitsuharu［14］對(duì)醫(yī)源老人及健康人腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道多胺進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)包括xylanlyticum梭桿菌和saccharolyticum梭桿菌在內(nèi)的梭桿菌ⅪVa亞型菌種及種系的細(xì)菌與高濃度多胺的產(chǎn)生相關(guān)。Dicksved等［15］研究發(fā)現(xiàn)患Crohn's病的同卵孿生子腸道菌群多樣性低于健康孿生子，證實(shí)了遺傳和/或環(huán)境因素一定程度上影響了腸道微生物群落的構(gòu)成。詹鑾峰等［16］針對(duì)16srRNA設(shè)計(jì)通用引物，利用T－RFLP技術(shù)分別對(duì)30例腹瀉患者和22例健康成年人糞便進(jìn)行比較，腹瀉患者均發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊亂，為腹瀉的診斷和治療提供了一定的依據(jù)。Khoruts等［17］通過(guò)細(xì)菌療法，將健康人的腸道菌群移植到由難治性梭狀芽孢桿菌造成腹瀉的病人體內(nèi)，最終使供體與受體腸道菌群的T－RF趨于一致。T－RFLP技術(shù)還被應(yīng)用在對(duì)疾病治療動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)過(guò)程中，通過(guò)腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化來(lái)觀測(cè)治療的效果。Kohyama［18］通過(guò)對(duì)實(shí)施過(guò)直腸結(jié)腸切除術(shù)病人的腸道菌群進(jìn)T－RF分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸菌群隨時(shí)間發(fā)生顯著的變化。該技術(shù)在治療頑固性UC的方法研究［19］、生物制劑對(duì)花粉過(guò)敏癥的影響［20］，具十字花蔬菜對(duì)非蔬菜水果膳食人群腸道菌群的改善［21］，生物制劑對(duì)心血管疾病患者腸道菌群的改變［22］等方面都成為強(qiáng)有力的輔助檢測(cè)方法。人體中的腸道菌群是按一定比例定植在人腸道內(nèi)的，具有生物屏障作用，其結(jié)構(gòu)與功能與人的生命緊緊相連。T－RFLP能快速、準(zhǔn)確的將其變化反映出來(lái)，進(jìn)而能為診斷及治療提供便捷。1.3T－RFLP在腸道菌群耐藥性研究的應(yīng)用隨著抗生素的濫用，抗生素的耐藥性已經(jīng)成為一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域及嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。將研究細(xì)菌耐藥性與T－RFLP技術(shù)相結(jié)合，可以從微生態(tài)角度進(jìn)一步分析抗生素的耐藥問(wèn)題。Cecilia等［23］分別對(duì)服用克林霉素前、中、后的8個(gè)健康志愿受試者進(jìn)行腸道菌群的分析，利用活菌計(jì)數(shù)和T－RFLP監(jiān)測(cè)每個(gè)個(gè)體的腸道微生物群體的組成和特異性菌株豐度的變化及受到克林霉素影響的特異性菌群。同時(shí)，該學(xué)者應(yīng)用該技術(shù)對(duì)抗生素對(duì)腸道微生態(tài)可能的長(zhǎng)期影響進(jìn)行了監(jiān)測(cè)［24］。他先后分析4例病人應(yīng)用7d克林霉素后腸道微生態(tài)的變化，連續(xù)2年的T－RFLP監(jiān)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)用藥組細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的持續(xù)性變化，且在觀察期間始終沒(méi)有恢復(fù)到用藥前的水平，而對(duì)照組的群落只有輕微且短暫的變化。4年的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示部分腸道菌群的多樣性能恢復(fù)到用藥以前，但是仍有部分特有菌群受到很大的影響［25］。日本學(xué)者通過(guò)對(duì)出生后4天內(nèi)使用了廣譜抗生素的嬰兒及在同時(shí)期母體注射過(guò)抗生素的剖腹產(chǎn)嬰兒的腸道菌群T－RF片段進(jìn)行分析，結(jié)果提示由于抗生素的使用，這些嬰兒腸道菌群的數(shù)量及多樣性，特別是雙歧桿菌和腸球菌比健康嬰兒少［26］。有研究者對(duì)正常人在服用β－內(nèi)酰胺類抗生素的過(guò)程中及服藥后均進(jìn)行微生態(tài)制劑干預(yù)(主要含有雙歧桿菌和乳酸桿菌)，腸道菌群T－RF結(jié)果說(shuō)明這種干預(yù)能加速腸道微生態(tài)平衡的恢復(fù)［27］。因此，臨床上可望通過(guò)微生態(tài)制劑的干預(yù)，改善由抗生素引起的腸道菌群紊亂，以求更好的維持人體的微生態(tài)平衡。以上研究結(jié)果充分表明，利用T－RFLP技術(shù)也許能從另一個(gè)角度詮釋細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制及傳遞方式，為人類遏制不斷增強(qiáng)的細(xì)菌耐藥性，以及疾病的治療提供一種新的思路。1.4T－RFLP在人腸道系統(tǒng)與其他系統(tǒng)比較中的應(yīng)用通過(guò)全自動(dòng)測(cè)序儀(genescan)分析得到的T－RFLP圖譜包含了T－RF的片段大小、峰高及峰面積。對(duì)圖譜的結(jié)果作進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，可以比較不同生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)。通過(guò)常用的Shannon－Wiener多樣性指數(shù)(H')的比較可以進(jìn)一步明確各種微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性，以及同一群落在空間水平隨時(shí)間而發(fā)生的變化［28］。Lisa［29］通過(guò)分析T－RFLP數(shù)據(jù)，對(duì)包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物腸道菌群進(jìn)行了對(duì)比分析，豐富了同源性研究的數(shù)據(jù)。Bernhard等［30］利用人糞和牛糞的T－RF峰圖上各自的特征峰為依據(jù)來(lái)判斷水的糞便污染源。2T－RFLP技術(shù)的研究前景T－RFLP不能對(duì)圖譜進(jìn)行雜交或者直接克隆測(cè)序，且由于數(shù)據(jù)庫(kù)的不完善，酶切的T－RF片段在數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配度不夠，有時(shí)無(wú)法鑒定到種屬水平。但這種作為不依賴培養(yǎng)的分析生物學(xué)分析方法，具有高通量、快速、準(zhǔn)確、分辨率較高的特點(diǎn)，而逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所青睞。RDP數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富，TAP分析軟件的推出都給T－RFLP數(shù)據(jù)的處理帶了方便。T－RFLP能分析的目的分子不僅限于16srRNA。選用某種功能基因作目的序列進(jìn)行分析，就能確定具有這種代謝功能微生物的組成情況。Marsh［31］研究發(fā)現(xiàn)延伸因子基因也可以應(yīng)用于T－RFLP分析，目前延伸因子的數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完善，但通過(guò)模擬分析獲得的T－RF片段較16srRNA更多。選擇其它的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記做目的序列還能取得特殊的分析成果。例如，選用16srRNA可以調(diào)查群落中有代謝活性的菌的組成情況，這是因?yàn)橛写x活性的菌比處于休眠狀態(tài)的菌含有更多的16srRNA，16srRNA就成為檢測(cè)有代謝活性的細(xì)菌的一種指標(biāo)。目前，T－RFLP已廣泛應(yīng)用于環(huán)境學(xué)、地質(zhì)地理學(xué)和微生物學(xué)的研究中，能夠較為全面的分析生態(tài)環(huán)境中的多樣性，并能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)菌群的變化。隨著該技術(shù)的不斷完善、應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，相信T－RFLP勢(shì)必在人腸道菌群與人類健康的研究領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。［參考文獻(xiàn)］［1］NagashimaK，HisadaT，SatoM，etal．ApplicationofNewPrimer－EnzymeombinationstoTerminalRestrictionFragmentLengthPolymor-phismProfilingofBacterialPopulationsinHumanFeces［J］．ApplEnvironMicrob，2021，69(2):1251－1262．［2］MatsumotoM，SakamotoM，HayashiH．Novelphylogeneticassignmentdatabaseforterminal－restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofhumancolonicmicrobiota［J］．JMicrobiolMethods，2021，61(3):305－319．［3］LiF，HullarMA，LampeJW．Optimizationofterminalrestrictionfrag-mentpolymorphism(T－RFLP)analysisofhumangutmicrobiota［J］．JMicrobiolMethods，2021，68(2):303－311．［4］AntoniaS，RegisB，MaleneS，etal．DirectAnalysisofGenesEncoding16SrRNAfromComplexCommunitiesRevealsManyNovelMolecularSpecieswithintheHumanGut［J］．ApplEnvironMicrob，2021，65(11):4799－4807．［5］SakataS，TonookaT，IshizekiS，etal．Culture－independentanalysisoffecalmicrobiotaininfants，withspecialreferencetoBifidobacteriumspecies［J］．FemsMicrobiolLett，2021，243(2):417－423．［6］WangM，AhereS，AntonssoM，etal．T－RFLPcombinedwithprincipalcomponentanalysisand16SrRNAgenesequencing:aneffectivestrategyforcomparisonoffecalmicrobiotaininfantsofdifferentages［J］．JMicrobiolMethods，2021，59(1):53－69．［7］DicksvedJ，F(xiàn)loistrupH，etal．Molecularfingerprintingofthefecalmicrobiotaofchildrenraisedaccordingtodifferentlifestyles［J］．ApplEnvironMicrob，2021，73(7):2284－2289．［8］HayashiH，SakamotoM，KitaharaM，BennoY，etal．MolecularAnalysisofFecalMicrobiotainElderlyIndividualsUsing16srRNALibraryandT－RFLP［J］，MicrobiolImmunol，2021，47(8):557－570．［9］HayashiH，TakahashiR，NishiT，etal．Molecularanalysisofjejunal，ileal，caecalandrecto－sigmoidalhumancolonicmicrobiotausing16SrRNAgenelibrariesandterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism［J］．JMedMicrobiol，2021，54(11):1093－1101．［10］FLayer，BGhebremedhin，K－AModer，etal．ComparativestudyusingvariousmethodsforidentificationofStaphylococcusspeciesinclinicalspecimens［J］．JClinMicrobiol，2021，44(8):2824－2830．［11］MWang，CKarlsson，COlsson，etal．Reduceddiversityintheearlyfecalmicrobiotaofinfantswithatopiceczema［J］．JAllergyClinImmun，2021，121(1):129－134．［12］AndohA，SakataS，KoizumiY，etal．TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphismAnalysisoftheDiversityofFecalMicrobiotainPatientswithUlcerativeColitis［J］．InflammBowelDis，2021，13(8):955－962．［13］WangY，HoenigJ，MalinK，etal．16SrRNAgene－basedanalysisoffecalmicrobiotafrompreterminfantswithandwithoutnecrotizingenterocolitis［J］．TheISMEJournal，2021，3(8):944－954．［14］MMatsumoto，YBenno，TheRelationshipbetweenMicrobiotaandPolyamineConcentrationintheHumanIntestine:APilotStudy［J］．MicrobiolImmunol，2021，51(1):25－35．［15］DicksvedJ，HalfvarsonJ，RosenquistM，etal．MolecularanalysisofthegutmicrobiotaofidenticaltwinswithCrohn'sdisease［J］．TheISMEJournal，2021，2(7):716－727．［16］詹鑾峰，高鵬，張卓然，等．T－RFLP快速分析慢性腹瀉患者腸道菌群及其應(yīng)用研究［J］．醫(yī)學(xué)研究通訊，2021，34(10):27－30．［17］KhorutsA，DicksvedJ，JanssonJK，etal．ChangesintheCompositionoftheHumanFecalMicrobiomeAfterBacteriotherapyforRecur-rentClostridiumDifficile－associatedDiarrhea［J］．JClinGastroen-tero，2021，44(5):354－360．［18］KohyamaA，OgawaH，F(xiàn)unayamaY，etal．Bacterialpopulationmovestowardacolon－likecommunityinthepouchaftertotalprocto-colectomy［J］．Surgery，2021，145(4):435－447．［19］TsudaY，YoshimatsuY，AokiH，etal．Clinicaleffectivenessofpro-bioticstherapy(BIO－THREE)inpatientswithulcerativecolitisre-fractorytoconventionaltherapy［J］．ScandJGastroentero，2021，42(11):1306－1311．［20］OdamakiT，XiaoJZ，IwabuchiN，etal．Fluctuationoffecalmicrobio-tainindividualswithJapanesecedarpollinosisduringthepollensea-sonandinfluenceofprobioticintake［J］．JInvestAllergClin，2021，17(2):92－100．［21］LiF，HullarMA，SchwarzY，etal．Humangutbacterialcommunitiesarealteredbyadditionofcruciferousvegetablestoacontrolledfruit－andvegetable－freediet［J］．JNutr，2021，139(9):1685－1691．［22］KarlssonC，AhrnS，MolinG，etal．Probiotictherapytomenwithincipientarteriosclerosisinitiatesincreasedbacterialdiversityinco-lon:arandomizedcontrolledtrial［J］．Atherosclerosis，2021，208(1):228－233．［23］JernbergC，SullivanA，etal．Monitori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社會(huì)實(shí)踐報(bào)告系別：班級(jí)：學(xué)號(hào)：姓名：作為祖國(guó)未來(lái)的事業(yè)的繼承人，我們這些大學(xué)生應(yīng)該及早樹立自己的歷史責(zé)任感，提高自己的社會(huì)適應(yīng)能力。假期的社會(huì)實(shí)踐就是很好的鍛煉自己的機(jī)會(huì)。當(dāng)下，掙錢早已不是打工的唯一目的，更多的人將其視為參加社會(huì)實(shí)踐、提高自身能力的機(jī)會(huì)。許多學(xué)校也積極鼓勵(lì)大學(xué)生多接觸社會(huì)、了解社會(huì)，一方面可以把學(xué)到的理論知識(shí)應(yīng)用到實(shí)踐中去，提高各方面的能力；另一方面可以積累工作經(jīng)驗(yàn)對(duì)日后的就業(yè)大有裨益。進(jìn)行社會(huì)實(shí)踐，最理想的就是找到與本專業(yè)對(duì)口單位進(jìn)行實(shí)習(xí)，從而提高自己的實(shí)戰(zhàn)水平，同時(shí)可以將課本知識(shí)在實(shí)踐中得到運(yùn)用，從而更好的指導(dǎo)自己今后的學(xué)習(xí)。但是作為一名尚未畢業(yè)的大學(xué)生，由于本身具備的專業(yè)知識(shí)還十分的有限，所以我選擇了打散工作為第一次社會(huì)實(shí)踐的方式。目的在于熟悉社會(huì)。就職業(yè)本身而言，并無(wú)高低貴賤之分，存在即為合理。通過(guò)短短幾天的打工經(jīng)歷可以讓長(zhǎng)期處于校園的我們對(duì)社會(huì)有一種更直觀的認(rèn)識(shí)。實(shí)踐過(guò)程：自從走進(jìn)了大學(xué)，就業(yè)問(wèn)題就似乎總是圍繞在我們的身邊，成了說(shuō)不完的話題。在現(xiàn)今社會(huì)，招聘會(huì)上的大字報(bào)都總寫著“有經(jīng)驗(yàn)者優(yōu)先”，可還在校園里面的我們這班學(xué)子社會(huì)經(jīng)驗(yàn)又會(huì)擁有多少呢？為了拓展自身的知識(shí)面，擴(kuò)大與社會(huì)的接觸面，增加個(gè)人在社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)中的經(jīng)驗(yàn)，鍛煉和提高自己的能力，以便在以后畢業(yè)后能真正真正走入社會(huì)，能夠適應(yīng)國(guó)內(nèi)外的經(jīng)濟(jì)形勢(shì)的變化，并且能夠在生活和工作中很好地處理各方面的問(wèn)題，我開始了我這個(gè)假期的社會(huì)實(shí)踐-走進(jìn)天源休閑餐廳。實(shí)踐，就是把我們?cè)趯W(xué)校所學(xué)的理論知識(shí)，運(yùn)用到客觀實(shí)際中去，使自己所學(xué)的理論知識(shí)有用武之地。只學(xué)不實(shí)踐，那么所學(xué)的就等于零。理論應(yīng)該與實(shí)踐相結(jié)合。另一方面，實(shí)踐可為以后找工作打基礎(chǔ)。通過(guò)這段時(shí)間的實(shí)習(xí)，學(xué)到一些在學(xué)校里學(xué)不到的東西。因?yàn)榄h(huán)境的不同，接觸的人與事不同，從中所學(xué)的東西自然就不一樣了。要學(xué)會(huì)從實(shí)踐中學(xué)習(xí)，從學(xué)習(xí)中實(shí)踐。而且在中國(guó)的經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，又加入了世貿(mào)，國(guó)內(nèi)外經(jīng)濟(jì)日趨變化，每天都不斷有新的東西涌現(xiàn)，在擁有了越來(lái)越多的機(jī)會(huì)的同時(shí)，也有了更多的挑戰(zhàn)，前天才剛學(xué)到的知識(shí)可能在今天就已經(jīng)被淘汰掉了，中國(guó)的經(jīng)濟(jì)越和外面接軌，對(duì)于人才的要求就會(huì)越來(lái)越高，我們不只要學(xué)好學(xué)校里所學(xué)到的知識(shí)，還要不斷從生活中，實(shí)踐中學(xué)其他知識(shí)，不斷地從各方面武裝自已，才能在競(jìng)爭(zhēng)中突出自已，表現(xiàn)自已。在餐廳里,別人一眼就能把我人出是一名正在讀書的學(xué)生,我問(wèn)他們?yōu)槭裁?他們總說(shuō)從我的臉上就能看出來(lái),也許沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)社會(huì)的人都有我這種不知名遭遇吧!我并沒(méi)有因?yàn)槲以谒麄兠媲皼](méi)有經(jīng)驗(yàn)而退后,我相信我也能做的像他們一樣好.我的工作是在那做傳菜生,每天9點(diǎn)鐘-下午2點(diǎn)再?gòu)南挛绲?點(diǎn)-晚上8:30分上班,雖然時(shí)間長(zhǎng)了點(diǎn)但