電子顯微鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)

電子顯微鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)第1頁/共48頁第七章電子顯微鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)一、電子顯微鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)慨述二、幾種常用的透射電鏡方法要點第2頁/共48頁一、電子顯微鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)慨述免疫組織化學(xué)技術(shù)為在細胞水平上研究免疫反應(yīng)做出了貢獻，但由于光學(xué)顯微鏡分辨率的限制，不可能從細胞超微結(jié)構(gòu)水平觀察和研究免疫反應(yīng)。因此，Singer于1959年首先提出用電子密度較高的物質(zhì)鐵蛋白(ferritin)標記抗體的方法，為在細胞超微結(jié)構(gòu)水平研究抗原抗體反應(yīng)提供了可能。在此基礎(chǔ)上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術(shù)、鐵蛋白抗鐵蛋白復(fù)合物技術(shù)、蛋白A—鐵蛋白標記技術(shù)、免疫酶技術(shù)及膠體金技術(shù)等。電子顯微鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)(以下簡稱免疫電鏡技術(shù))區(qū)別于免疫細胞化學(xué)和常規(guī)電鏡技術(shù)主要在以下幾方面：第3頁/共48頁（一）組織固定與取材（二）免疫染色（三）包埋

（四）對照試驗第4頁/共48頁（一）組織固定與取材既要保存良好的細胞超微結(jié)構(gòu)，又要注意保持組織的抗原性。因此，選用固定劑不宜過強。常采用灌注固定法。常用的免疫電鏡固定劑有多聚甲醛—戊二醛混合液和過碘酸—賴氨酸一多聚甲醛液(Periodate-Lysine-Paraformaldehyde,PLP液)或4％多聚甲醛液。國外不少文獻推薦應(yīng)用PLP液于免疫電鏡技術(shù)，認為該固定液對含糖類豐富的組織固定效果特佳，因為組織抗原絕大多數(shù)由蛋白質(zhì)和糖兩部分組成，抗原決定簇位于蛋白部分，有選擇地使糖類固定，就可使抗原性穩(wěn)定。第5頁/共48頁PLP液中過碘酸能氧化糖類，使其產(chǎn)生醛基，再經(jīng)賴氨酸作用，使新形成的醛基分子間和分子內(nèi)相互連接，穩(wěn)定組織抗原。但賴氨酸價格較貴，不如多聚甲醛—戊二醛固定液經(jīng)濟、簡便、效果佳。在取材方面，免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學(xué)技術(shù)要求更迅速、精細。第6頁/共48頁（二）免疫染色電免疫組化鏡分為三種:包埋前染色包埋后染色超薄冰凍切片第7頁/共48頁1．包埋前染色

將固定組織經(jīng)振動切片機切50um切片后，先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽性部位取出，修整成小塊，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋。如果特異性免疫反應(yīng)的范圍太小，為了準確定位，可作第二次包埋，即第一次包埋時將組織置于兩層thermanox塑料片之間，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式，進行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。第8頁/共48頁

包埋前染色的組織，以中層較為理想。表層因受機械修整，結(jié)構(gòu)往往保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應(yīng)弱或無。在作超薄切片前應(yīng)先切半薄切片，尋出免疫反應(yīng)陽性部位。在HE或甲苯胺藍染色的半薄切片上，免疫反應(yīng)部位呈棕黃色。據(jù)此定位作超薄切片，可大大提高陽性反應(yīng)檢出率。為避免電鏡鉛、鈾染色反應(yīng)與免疫反應(yīng)之間的混淆，可取相連續(xù)的超薄切片，分別以兩個銅網(wǎng)撈取，其中之一進行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進行對照觀察。第9頁/共48頁包埋前染色法的優(yōu)點是：①切片染色前不經(jīng)過鋨酸后固定、脫水及樹脂包埋等過程，抗原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應(yīng)。②可在免疫反應(yīng)陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率。特別適用于含抗原量較少的組織，但由于經(jīng)過一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超微結(jié)構(gòu)損傷。第10頁/共48頁2．包埋后染色組織標本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后，再進行免疫組化染色。由于是以貼在網(wǎng)上的超薄切片進行免疫染色，故又名之載網(wǎng)染色(ongridstaining)。必須指出的是：①后固定中是否應(yīng)用四氧化鋨存在不同意見，一般以不用四氧化鋨為佳，或盡量縮短在四氧化鋨中停留的時間。有作者認為，從理論上講，四氧化鋨具有保存抗原的作用，但實踐證明應(yīng)用四氧化鋨可使抗原活性明顯減低。第11頁/共48頁②在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，故需選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。③在免疫組化處理的全過程中，應(yīng)注意保持網(wǎng)面的濕潤，網(wǎng)面干燥會影響抗體活性。第12頁/共48頁本法的優(yōu)點是超微結(jié)構(gòu)保存較好，方法簡便，陽性結(jié)果有高度的可重復(fù)性，還能在同一超薄切片上進行多重免疫染色。但抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì)；包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進行免疫反應(yīng)等。第13頁/共48頁因此，免疫組化工作者曾試圖以不同的方法，如，飽和苯溶液，無水酒精中NaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等以減少或去除包埋劑，取得不同程度的效果。為克服后一缺點，現(xiàn)普遍采用的是在進行免疫染色前，將載網(wǎng)超薄切片以H202液蝕刻數(shù)分鐘，以去除四氧化鋨和增強樹脂的穿透性。第14頁/共48頁3．超薄冰凍切片按照Tokuyasu建立的方法，將組織置于2.3moI／L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機上切片，切片厚度可略厚于常規(guī)樹脂切片。冰凍超薄切片由于不需經(jīng)固定、脫水、包埋等步驟，直接進行免疫染色，所以抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點。但技術(shù)條件要求較高、難度較大。第15頁/共48頁（三）包埋1．樹脂包埋2．低溫包埋第16頁/共48頁1．樹脂包埋國內(nèi)現(xiàn)普遍采用的是環(huán)氧樹脂包埋法，可直接脫水后包埋，也可將小片組織或半薄切片貼在載片上，將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置于切片上聚合、硬化，進行原位包埋。第17頁/共48頁2．低溫包埋常規(guī)樹脂包埋由于需高溫聚合等處理程序，組織抗原性可能全部或部分丟失。因此，在免疫電鏡技術(shù)方面，國外不少實驗室已開始采用低溫技術(shù)如低溫包埋和冰凍超薄切片等，后者需配備冰凍超薄切片機，且技術(shù)難度較大，不如低溫包埋法易推廣。低溫包埋劑的研究開始于60年代，80年代免疫細胞化學(xué)技術(shù)在電鏡水平上的廣泛應(yīng)用，為低溫包埋劑的實驗研究開辟了廣闊的領(lǐng)域。第18頁/共48頁

國外已有較多的應(yīng)用報道，國內(nèi)一些實驗室已開始摸索。作為低溫包埋劑的多為乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate，GMA)，Lowicryls，LRWhite和LRGold等，目前國外生產(chǎn)廠家有PolysciencesINC，Reichert-Jung和LKB等系列產(chǎn)品。現(xiàn)將常用的幾種低溫包埋劑及其應(yīng)用簡單介紹如下：第19頁/共48頁

（1）Lowicryls是丙烯酸鹽(acrylate)和甲基丙烯酸鹽(methacrylate)化學(xué)物質(zhì)，包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列產(chǎn)品。其特點是能在低溫下保持低粘度(K4M：－35℃；HM20：－70℃；K11M、HM23：－60℃～－80℃)和具有在光照射(紫外光，波長360nm)下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無關(guān)。第20頁/共48頁

其中K4M和K11M具有親水性，特別適合于免疫細胞化學(xué)的應(yīng)用，因為它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于掃描、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作。所有這些種類的低溫包埋劑都適用于冰凍置換技術(shù)。K4M的應(yīng)用和報道較多，現(xiàn)介紹如下：第21頁/共48頁包埋劑的配制：由三個部分組成：單體(Monomer)，交聯(lián)劑(Crosslinker)和引發(fā)劑(Initator)。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：

K4M：單體17.30g

交聯(lián)劑2.70g

引發(fā)劑0.10g

可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色的玻璃容器以避光，用玻棒輕攪3—5min或用一小管通人液氮氣泡以攪拌之。勿過分攪拌，以防氧的氣泡進入包埋劑中。第22頁/共48頁2)生物樣品處理程序

①動物麻醉取材，以多聚甲醛一賴氨酸—過碘酸鈉在9℃固定2h。②PBS含7％蔗糖，pH7.2，沖洗過夜，0℃③0.1mol／LPBS，pH7.2沖洗，0℃④脫水：65％乙醇．1h，0℃80％乙醇，2h，－35℃K4M：80％乙醇=l：l1h，－35℃K4M：80％乙醇=2：11h，－35℃100％K4M1h，－35℃100％K4M過夜，－35℃

第23頁/共48頁⑤包埋：新鮮K4M置于膠囊內(nèi)，將組織移入，在一30℃～一40℃以紫外線燈波長：360nm2×15W(LaddResearchIndustnesBurlingtonVT)相距30～40cm照射24h使之聚合。如為100W燈泡，照射距離應(yīng)大于85cm。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續(xù)照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。第24頁/共48頁3)免疫染色①切片(厚50—70nm)貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上。所有下列步驟在室溫、濕盒內(nèi)進行。所有溶液需經(jīng)微孔濾紙(0.25～0.45um)濾過。②正常羊血清30min。③第一抗血清(PBS稀釋)，37℃2h。④可用燒杯法(或塑料壺噴洗法)，以鑷夾鎳網(wǎng)在第一燒杯中洗蕩30min，然后在第二燒杯中洗蕩lh。⑤正常羊血清30min。

第25頁/共48頁⑥第二抗血清以正常羊血清稀釋為1：1，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育lh。⑦沖洗如④。⑧覆于2％OsO4水溶液上，30min。⑨沖洗如④。⑩干燥后在電鏡下觀察。

Lowicryls應(yīng)保存在暗處，一4℃，該物質(zhì)有刺激性，在配制時應(yīng)戴手套，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸汽刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應(yīng)立即以水沖洗局部。第26頁/共48頁

（2）LRwhite和LRgold是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂，具有極低的粘度和較強的嗜水性，因此有較強的穿透性，有利于抗體(或抗原)和免疫化學(xué)物質(zhì)穿過LR樹脂，達到組織結(jié)合部位。在免疫細胞化學(xué)的光鏡(半薄切片)和電鏡水平應(yīng)用都具有良好效果。標本脫水至70％乙醇即可，能較好地保持抗原性。生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。第27頁/共48頁

（3）GMA是乙二醇甲基丙烯酸酯(GlycolMethacrylate即2-hydroxyethylmethacrylate,HEMA)的縮寫。

GMA作為電鏡包埋劑的優(yōu)點：①電子密度大；②影像反差好。主要缺點：①包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。②聚合過程中易造成組織損傷如人為的細胞器腫脹。③缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束的轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。

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聚合后的環(huán)氧樹脂有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不夠滿意始終是個有待解決的問題。而GMA包埋切片的染色效果明顯優(yōu)于環(huán)氧樹脂。于是電鏡工作者嘗試以增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸丁脂和水使之變軟，Spaur和Marlarty(1977)在此基礎(chǔ)上除了加用丁基甲基丙烯酸酯和少量水外，并加人適量的增塑劑如聚乙二醇400(PEG400)以改變其硬度，加入適量的交聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯(ethylenedimethaerylate)以增強其抗電子束轟擊的穩(wěn)定性。第29頁/共48頁

為避免聚合時過快，產(chǎn)生高溫，損傷組織結(jié)構(gòu)，選用低溫型引發(fā)劑—過氧化苯甲酰(BenzoylPeroxide)，溫度范圍一10℃～一300℃。經(jīng)過不斷的配制改進，現(xiàn)GMA已廣泛應(yīng)用于半薄切片(1～3um)的光鏡觀察，特別是組織化學(xué)方面的研究和電鏡水平的免疫細胞化學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)將GMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細胞化學(xué)染色方法簡介如下：第30頁/共48頁1)GMA單體溶液在出廠時都加有氫醌類穩(wěn)定劑，用前須以每25ml單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩5min，過濾以除去氫酯，以免影響聚合。

2)包埋劑的配制：

a.100％GMAN-甲基丙烯酸丁酯66.5ml5％乙烯二甲丙烯酸酯28.5ml1.5％過氧化苯甲酰1.0g1.0％PEG4001.0ml

第31頁/共48頁b．A液：

GMA單體液90mlPFGz3005～9.4ml

過氧化苯甲酰0.2～0.69g

攪拌溶解后置棕色瓶內(nèi)；4℃保存。

B液：

PEGz40020m

二甲基苯胺1ml

應(yīng)用時A：B按10：1比例充分混。第32頁/共48頁3)生物樣品處理：組織固定可用PLP液或1％戊二醛溶液(磷酸緩沖液配制，pH7.4)。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的GMA單體溶液中浸24h。以上步驟可在室溫或4℃進行。

4)包埋聚合：組織移入盛滿包埋液的膠囊內(nèi)，先放在真空泵內(nèi)以去除包埋液中的氣泡，然后在4℃，以紫外線燈(波長360nm)在距膠囊底部10～20cm處進行照射12～16h，以手指捏膠囊試其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟人熱水中以去除膠囊外殼。第33頁/共48頁5)切片貼在鎳網(wǎng)上，按膠體金標記蛋白A技術(shù)（ProteinA-goldtechnique,PAg法）進行包埋后染色，其區(qū)別于EPON包埋劑者，在于GMA包埋切片染色所需時間較短，在第一抗血清中，GMA室溫只需孵育lh，而EPON包埋切片需16—20h：在第二抗血清，即PAg復(fù)合物中室溫30min，而EPON包埋切片需lh。鈾、鉛雙染后，電鏡觀察?！蜏匕駝┏Ｓ糜阼F蛋白或膠體金免疫電鏡技術(shù)的包埋后染色。能檢出應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的多種抗原。第34頁/共48頁（四）對照試驗

為確定方法的特異性，免疫電鏡技術(shù)也需要進行對照試驗。

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總之，不論哪一種免疫電鏡技術(shù)都面臨微細結(jié)構(gòu)的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾。如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細結(jié)構(gòu)的保存，但對抗原活性有影響，而H202能增加樹脂穿透性，但對微細結(jié)構(gòu)有損傷，能使反應(yīng)部位產(chǎn)生孔洞。在生物樣品處理過程中，應(yīng)同時注意到這兩個方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作應(yīng)注意徹底，否則非特異性產(chǎn)物和其他污染物會影響特異性反應(yīng)產(chǎn)物的顯示和觀察。第36頁/共48頁二、幾種常用的透射電鏡方法要點

（一）鐵蛋白標記免疫電鏡技術(shù)

（二）過氧化物酶標記免疫電鏡技術(shù)

（三）膠體金標記免疫電鏡技術(shù)第37頁/共48頁（一）鐵蛋白標記免疫電鏡技術(shù)1．原理鐵蛋白是一種含鐵約占23％的蛋白質(zhì)，分子量460kD，直徑10～12um?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的雙功能試劑結(jié)合為一種雙分子復(fù)合物。第38頁/共48頁

此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有致密的鐵離子核心，鐵膠粒直徑的核心為55～60nm含2000～3000個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，便于電鏡觀察。其優(yōu)點是鐵蛋白易從馬脾中獲得，呈顆粒狀，易分辨；其缺點是分子量較大，不易穿透細胞膜和組織，對于細胞內(nèi)抗原的定位較困難。第39頁/共48頁2．方法常采用包埋前免疫染色，分為直接法和間接法。（1）直接法：即將切片直接浸于標記的特異性抗體內(nèi)，于室溫或37℃作用1～2h以上，緩沖液洗凈，再按常規(guī)電鏡后固定、脫水、包埋。（2）間接法：將切片經(jīng)一抗室溫孵育30～60min后，充分洗滌(3×30min)，浸入標記二抗室溫孵育30min，充分洗滌、后固定、脫水、包埋。第40頁/共48頁（二）過氧化物酶標記免疫電鏡技術(shù)1．原理利用酶作為抗原抗體復(fù)合物的標記物，再經(jīng)酶對底物作用生成有較高電子密度的產(chǎn)物。第41頁/共48頁2．方法這里簡單介紹包埋前和包埋后PAP免疫染色法。（1）包埋前PAP法：①組織灌注固定。②振動切片機切30～50um厚片。③入正常羊血清(5％～10％，PBS稀釋)室溫孵育30min。

第42頁/共48頁（2）包埋后PAP法：①載有超薄切片的鎳網(wǎng)入5％H2O2液內(nèi)蝕刻2～3min，生理鹽水洗，濾紙吸干。②5％正常羊血清(TBS稀釋)，室溫5min。③加一抗(TBS稀釋，內(nèi)含l％正常羊血清)，4℃孵育48h，后用TBS洗。④5％正常羊血清，室溫5min。