細(xì)菌與酵母表面展示技術(shù)課件

細(xì)菌表面展示技術(shù)

酵母表面展示技術(shù)

第七組定義：細(xì)菌表面展示技術(shù)是利用基因工程手段將某一蛋白或短肽段（靶蛋白）與微生物外膜蛋白（載體蛋白）以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在細(xì)胞表面。外源蛋白與載體蛋白結(jié)合方式C端融合(N端錨定在外膜)N端融合

(C端錨定在外膜)夾心融合(有些蛋白本身具有信號肽序列及錨定于外膜的序列，內(nèi)部合適位點(diǎn)插入外源蛋白)早期研究多集中在革蘭氏陰性菌。原因是遺傳背景清楚，便于控制蛋白展示。但是從應(yīng)用上來看，革蘭氏陽性菌的某些特性更適合于表面展示。如下表：缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率低，限制構(gòu)建較大容量的肽庫；一些革蘭氏陽性菌分泌大量蛋白酶，這會給應(yīng)用帶來麻煩。細(xì)菌表面展示技術(shù)，結(jié)合熒光激活細(xì)胞篩選儀或流式細(xì)胞篩選儀，是非常有效的高通量篩選方法。優(yōu)點(diǎn)：1、能夠決定突變體庫中每個(gè)克隆的功能特性。2、目前唯一能夠定量檢驗(yàn)單細(xì)胞水平和大量突變體催化活性的方法。3、定量分析酶活性4、同時(shí)檢測多個(gè)參數(shù)并且對每個(gè)觀察到的克隆進(jìn)行記錄。與噬菌體相比：細(xì)菌表面展示技術(shù)在疫苗應(yīng)用上具有獨(dú)特優(yōu)勢；進(jìn)行更快速更高效篩選與傳統(tǒng)的生物陶選技術(shù)相比，熒光激活細(xì)胞篩選儀具有以下特色

①高富集比

②高陽性率

③避免“親和效應(yīng)”綜上所述，細(xì)菌表面展示系統(tǒng)靈活多樣，操作簡便，在多個(gè)領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景，隨著新的載體系統(tǒng)的發(fā)展和其自身的不斷完善，細(xì)菌表面展示技術(shù)必將在實(shí)踐中發(fā)揮更大的作用。酵母表面展示技術(shù)

簡介：

酵母表面展示系統(tǒng)是繼噬菌體展示技術(shù)創(chuàng)立以后發(fā)展起來的展示系統(tǒng)。酵母的蛋白質(zhì)折疊和分泌機(jī)制與哺乳動物的細(xì)胞非常相似，對人的蛋白質(zhì)表達(dá)和展示具有優(yōu)越性。酵母細(xì)胞顆粒大，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選和分離。目前報(bào)道的兩種酵母展示系統(tǒng)分別以α-凝集素作為融合骨架。1.目的蛋白-α-凝集素表面展示系統(tǒng)此系統(tǒng)將目的蛋白作為N端，與α-凝集素C端部分融合，目的蛋白經(jīng)α-凝集素展示酵母細(xì)胞表面。α-凝集素共價(jià)連接到細(xì)胞壁的葡聚糖上，其錨定部位由蛋白質(zhì)C端320個(gè)氨基酸組成，富含Ser/Thr殘基。Ser/Thr富集區(qū)因廣泛存在的O-糖基化而擁有的一個(gè)桿狀構(gòu)象，可作為空間支持無發(fā)揮作用。迄今，已有多個(gè)應(yīng)用α-凝集素的C端作為融合蛋白的報(bào)道。第一個(gè)通過此系統(tǒng)表達(dá)的異源蛋白是α-半乳糖苷酶。Schreuder等將來自瓜兒豆膠的α-半乳糖苷酶的基因插入到釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶分泌信號和α-凝集素C端部分編碼序列之間。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶-α-凝集素（α-Gal-ACI）融合蛋白，均由固有的磷酸果糖激酶(PGK)啟動子控制，并且是多拷貝的。批量培養(yǎng)過程中檢測了細(xì)胞和生長介質(zhì)中的酶活性，α-半乳糖苷酶被高效分泌入培養(yǎng)介質(zhì)，而αGal-ACI融合蛋白主要與細(xì)胞有關(guān)。天然α-凝集素結(jié)合活性部位在Aga2p的C端，因此，此處代表了一個(gè)細(xì)胞外大分子的可及性區(qū)域和展示固定蛋白質(zhì)的有用位點(diǎn)。

酵母有兩種交配類型MATa和MATa的單倍體細(xì)胞，這兩種細(xì)胞之間的相互交配融合是通過細(xì)胞表達(dá)α-凝集素和α-凝集素的相互作用介導(dǎo)的。目前，酵母表面展示技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子的相互識別、定向進(jìn)化以及新型疫苗的研制等發(fā)面。①蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化：酵母表面展示系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)親和力和穩(wěn)定性的定型進(jìn)化已有成功報(bào)道，最先被用于抗體的親和力成熟;②活的口服疫苗：在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)易于接近抗體，因此，可被免疫系統(tǒng)識別，即使很小的肽，當(dāng)展示在細(xì)胞表面時(shí)，也具有免疫原型。因而可通過在酵母表面表達(dá)異質(zhì)性的抗原蛋白來發(fā)展疫苗。酵母是個(gè)足夠大的顆粒，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選和分離，這就使得基于特異定量親和力改變的的突變體分離成為可能。由于酵母展示的蛋白質(zhì)是緊密錨定在細(xì)胞壁上，可以耐受SDS等的抽取，同時(shí)酵母有發(fā)酵特性且生長快，因此在工業(yè)上具有很好的應(yīng)用前景。

前景：

表面展示技術(shù)日新月異，酵母展示系統(tǒng)在不斷的完善和改進(jìn)