制劑的基本生產(chǎn)技術(shù)病毒增殖技術(shù)優(yōu)秀公開(kāi)課

第九講

病毒增殖技術(shù)一、病毒的復(fù)制、增殖與營(yíng)養(yǎng)吸附：非特異性靜電－特異性受體影響因素：溫度、陰、陽(yáng)離子侵入：病毒直接進(jìn)入胞漿；細(xì)胞吞飲病毒；病毒囊膜與細(xì)胞融合生物合成：細(xì)胞漿或細(xì)胞核中完成早期：合成酶類(lèi)、核苷酸原料晚期：合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白裝配：細(xì)胞漿或細(xì)胞核中完成核酸、蛋白質(zhì)盤(pán)曲濃縮＋多肽－包殼＋細(xì)胞膜的脂質(zhì)、糖類(lèi)和病毒蛋白－病毒顆粒釋放：細(xì)胞通道溢出；細(xì)胞死亡自溶釋出；細(xì)胞膜出芽；細(xì)胞膨脹破裂放出掌握不同病毒的增殖規(guī)律，獲得高滴度病毒，對(duì)研制高質(zhì)量生物制品十分重要。二、動(dòng)物增殖病毒技術(shù)動(dòng)物的選擇：1大動(dòng)物應(yīng)來(lái)源于非疫區(qū)，最好是未接種過(guò)相應(yīng)病毒疫苗、青壯年和健康2對(duì)相應(yīng)病毒易感，并十分敏感3經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀(guān)察檢查證明健康4家兔、大、小鼠等應(yīng)符合普通級(jí)或清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)；雞應(yīng)屬非免疫雞或SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；犬、貓應(yīng)品種明確，并符合普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)5體重、年齡要基本一致，個(gè)體差別不宜過(guò)大4靜脈接種：大小鼠的尾靜脈；兔耳緣靜脈；犬、豚鼠前肢皮下靜脈或后肢小隱靜脈；靈長(zhǎng)類(lèi)可用股靜脈、隱靜脈、前肢皮下頭靜脈；山羊頸靜脈，小型豬耳靜脈、頸靜脈或前大靜脈，雞翼下靜脈，犬舌下小靜脈5腹腔接種6腦內(nèi)接種三、禽胚增殖病毒技術(shù)禽胚的選擇1SPF雞胚：無(wú)雞的特定的22種病原體2非免疫雞胚：無(wú)特定病原的母源抗體3鴨胚：無(wú)干擾抗體的健康鴨胚1卵黃囊2卵白3尿囊腔4羊膜腔5氣室6殼膜1選擇10～13日齡的雞胚，劃出氣室和胚位2消毒后在氣室部位鉆一小孔，在雞胚面避開(kāi)血管鉆一小孔，勿穿透絨毛尿囊膜3用橡膠吸球緊貼氣室孔輕輕一吸，使雞胚面小孔處的絨毛膜下陷造成人工氣室4在人工氣室孔注入0.1～0.2ml病毒液，輕搖雞蛋使病毒液均勻散布于絨毛尿囊膜上5用石蠟封口，35－37℃培養(yǎng)1選用10～13日齡雞胚2在氣室部位距氣室分界線(xiàn)3～5mm處打一小孔3用細(xì)針頭斜向蛋殼面插入約5mm，再退出于氣室內(nèi)注射4封口后直立，37℃，2h，不翻蛋5常規(guī)孵化，每日照蛋2次，及時(shí)取出死亡胚4℃，12h收獲

消毒后，去除蛋殼和殼膜，用滅菌鑷子輕輕夾起絨毛尿囊膜，并沿氣室周?chē)鷮⒔q毛尿囊膜全部剪下，取病變明顯部位，經(jīng)研磨制成病毒懸液尿囊腔接種用于新城疫病毒、鴨傳染性肝炎病毒和傳染性支氣管炎病毒卵黃囊接種法

5～8日齡雞胚，在氣室中心殼上鉆一小孔針頭沿胚的縱軸插入約30mm，封口，孵化主要用于立克次氏體、鸚鵡熱衣原體及某些病毒的增殖收獲：無(wú)菌撕破絨毛尿囊膜和羊膜，夾起雞胚切斷卵黃帶置于滅菌平皿中。如系收獲雞胚則將雞胚低溫保存?zhèn)溆?；如系收獲卵黃囊則將內(nèi)容物倒入平皿中，用鑷子將卵黃囊及絨毛尿囊膜分開(kāi)，用滅菌生理鹽水沖去卵黃，取卵黃囊低溫保存?zhèn)溆醚蚰で唤臃N法：1、操作在照蛋燈下進(jìn)行，取10～12日齡雞胚直立于蛋盤(pán)上，劃出氣室和胚胎位置2、在氣室端靠近胚胎側(cè)的蛋殼上鉆孔，將注射器針頭輕輕刺向胚體，當(dāng)稍感抵抗時(shí)即可注入病毒液將注射器針頭刺向胚體，以針頭撥動(dòng)胚體下顎或腿，如胚體隨針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，說(shuō)明針頭已進(jìn)入羊膜腔，注射病毒液3、封口孵化，收獲方法與尿囊腔接種方法同病毒感染雞胚全部組織，且可以通過(guò)胚體泄入尿囊腔胚體接種法1、接種方法同腦內(nèi)接種2、針頭刺入胚體內(nèi)接種靜脈接種法1、11～14日齡雞胚，照蛋，選取絨毛尿囊膜上大而直的靜脈，并在蛋殼上劃一長(zhǎng)方形記號(hào)，并劃出血流方向2、用蛋鉆在注射部位開(kāi)一長(zhǎng)方形裂痕，除去蛋殼，于蛋殼內(nèi)膜上滴一滴滅菌液體石蠟，使靜脈透明可見(jiàn)3、用注射器順血流方向刺入血管注入0.05～0.2ml病毒液，拔出針頭可以不封口，孵化，棄掉24h內(nèi)死胚4、收獲時(shí)按腦內(nèi)接種法沿反血流方向靜脈插入針頭，可得0.05～0.5ml血液，或去除氣室蛋殼，滴一滴滅菌液體石蠟于蛋膜，通過(guò)蛋膜用針頭刺破內(nèi)部大血管，使血液滲出殼膜之上，用吸管吸取，可得0.5ml血液（三）影響禽胚增殖病毒的因素種蛋質(zhì)量：

病原微生物：污染制品本身，又影響接種病毒在雞胚中的增殖

母源抗體：影響病毒在雞胚內(nèi)的增殖

抗生素：影響病原體的增殖接種技術(shù)：

不同病毒有不同的接種途徑，同種病毒接種不同日齡的禽胚獲得的病毒量也不同；尿囊腔接種時(shí)，根據(jù)病毒培養(yǎng)所需時(shí)間選擇最恰當(dāng)?shù)慕臃N胚齡；嚴(yán)格操作，接種時(shí)不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響其發(fā)育。禽胚污染：接種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作定期清掃消毒孵化室，保持空氣新鮮種蛋入孵前要清洗、消毒、晾干四、細(xì)胞增殖病毒技術(shù)細(xì)胞的選擇：病毒須在敏感的宿主細(xì)胞中增殖宿主細(xì)胞一般選擇相應(yīng)易感動(dòng)物的組織細(xì)胞可以根據(jù)病毒的細(xì)胞感染譜來(lái)選擇細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)病毒要素血清：56℃滅活30min，為了克服非特異性抑制因子的作用，血清濃度不超過(guò)2％溫度：37℃pH：7.6～7.8接毒量與接種方法：按維持液的1～10％（V/V)量接種；異步接毒和同步接毒支原體污染問(wèn)題影響病毒的增殖1干擾素誘導(dǎo)與干擾素活性抑制2病毒、支原體對(duì)共同營(yíng)養(yǎng)需