講生物技術(shù)公開課課件

1第12講生物技術(shù)

第一節(jié)生物技術(shù)概述第二節(jié)基因工程第三節(jié)其它生物技術(shù)發(fā)光樹2第一節(jié)生物技術(shù)概述生物技術(shù)將主導(dǎo)人類歷史的第三次技術(shù)革命第一次技術(shù)革命 工業(yè)革命 解放人的雙手第二次技術(shù)革命 信息技術(shù) 擴展人的大腦第三次技術(shù)革命 生物技術(shù) 改造生命本身生物技術(shù)的發(fā)展為人類帶來了巨大的利益和財富，將是未來經(jīng)濟發(fā)展的新動力。3生物工程簡史傳統(tǒng)發(fā)酵釀酒、制醬、制醋技術(shù)1860年，Pausteur單一霉菌純粹培養(yǎng)技術(shù)1878年，啤酒酵母單一培養(yǎng)技術(shù)1881年，細菌的純粹培養(yǎng)技術(shù)1929年，發(fā)現(xiàn)抗菌素“盤尼西林”1946年，用細菌生產(chǎn)出氨基酸1952年，用微生物轉(zhuǎn)化荷爾蒙獲得成功1953年，Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1956年，Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶1966年，破譯了氨基酸三聯(lián)密碼子世界上第一個生物技術(shù)公司1976年4月7日，HerbBoyer和BobSwanson創(chuàng)建了Genentech公司，標志著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的誕生。5生物技術(shù)應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理，依靠微生物、動物、植物體對物料進行加工，以提供產(chǎn)品為社會服務(wù)的技術(shù)——1982年，國際合作與發(fā)展組織以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的——1986年，國家科委現(xiàn)代生物技術(shù)傳統(tǒng)生物技術(shù)：微生物發(fā)酵，一般可分為上游/中游/下游過程現(xiàn)代生物技術(shù)：以DNA重組為主要手段的基因工程為核心，也包括酶工程/細胞工程/發(fā)酵工程等；多學(xué)科交叉；廣泛使用計算機及各種高科技儀器設(shè)備；應(yīng)用領(lǐng)域廣泛9生物工程的內(nèi)容和特點生物工程的四大體系：基因工程細胞工程蛋白質(zhì)工程發(fā)酵工程生物工程的顯著特點：高技術(shù)（精細和密集的復(fù)雜技術(shù)）高投入（尤其是前期科研投入高）高利潤10第二節(jié)基因工程基因工程就是將不同生物的外源DNA(基因）插入到載體分子上，形成“雜種”DNA分子，導(dǎo)入受體細胞中擴增和表達，從而得到期望的由這個外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。重組DNA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟。112.1理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明導(dǎo)致了基因工程的誕生理論上的三大發(fā)現(xiàn)：DNA為遺傳物質(zhì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和DNA半保留復(fù)制機制遺傳密碼與中心法則技術(shù)上的三大發(fā)明：限制性內(nèi)切酶和連接酶載體逆轉(zhuǎn)錄酶1973年，完成了DNA的體外重組并成功轉(zhuǎn)化13限制性內(nèi)切酶——DNA的“手術(shù)刀”限制性內(nèi)切酶：生物工程中最重要的工具酶，主要從原核生物中提取；它能識別雙鏈DNA分子中的特異性核苷酸序列，使它在特定的位點水解。Arber、Smith和Nathans因為在發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面的開創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎該種酶已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種14EcoRI和T4連接酶EcoRI特異識別GAATTC粘性末端常見限制性內(nèi)切酶1517細菌質(zhì)粒pUC18多克隆位點182.2重組DNA的一般操作步驟1、獲得目的基因2、構(gòu)建重組DNA分子3、轉(zhuǎn)化受體細胞4、篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子5、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞獲得所需的遺傳性狀或產(chǎn)物19（1）獲得目的基因分離逆轉(zhuǎn)錄從生物基因組中分離基因組DNA酶切產(chǎn)物總RNAmRNAcDNA人工合成化學(xué)合成PCR21紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度22基因文庫的構(gòu)建23反轉(zhuǎn)錄人工合成cDNA25（2）構(gòu)建重組DNA分子外源DNA質(zhì)粒酶切位點酶切位點酶切酶切混合DNA連接酶26（3）將重組DNA引入宿主細胞轉(zhuǎn)化：某一基因型細胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細胞的DNA，而使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染：除去蛋白質(zhì)外殼的病毒核酸感染細胞或原生質(zhì)體的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：用噬菌體做載體，將一個細胞的基因傳遞給另一個細胞的過程.

29農(nóng)桿菌介導(dǎo)30（4）對轉(zhuǎn)化子的篩選篩選：從大量攜帶重組體DNA的宿主細胞中分離出攜帶目的基因的細胞。篩選方法：遺傳學(xué)方法——對于帶有抗藥性基因的質(zhì)粒，可通過檢測受體菌是否由敏感狀態(tài)變成抗藥狀態(tài)進行篩選.免疫學(xué)方法——用特異性抗體檢測基因產(chǎn)物從而篩選陽性克隆的方法31Southern雜交——轉(zhuǎn)化子的分析32將老鼠的基因轉(zhuǎn)到大腸桿菌中抽取DNA切下鼠DNA切開質(zhì)粒DNA將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞混合、連接33將老鼠的基因轉(zhuǎn)到大腸桿菌中培養(yǎng)基中加抗生素培養(yǎng)裂解細胞釋放DNA分子雜交分離擴增目的克隆342.3基因工程應(yīng)用基因工程在醫(yī)學(xué)上被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)－肽類藥物。10g胰島素1000磅牛胰200升發(fā)酵液干擾素1200升人血1升發(fā)酵液2－3萬美元/病人200－300美元/病人35基因工程技術(shù)提高奶酪產(chǎn)量哺乳小牛胃凝乳酶凝乳酶基因啤酒酵母轉(zhuǎn)入制造奶酪36轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因植物獲得新的性狀372002年全球轉(zhuǎn)基因作物種植情況38轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物首先在小鼠獲得成功?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已用于牛、羊，使得從牛/羊奶中可以生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物。稱為“乳腺反應(yīng)器”工程。例如：從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA蜘蛛山羊轉(zhuǎn)基因山羊能通過乳腺分泌產(chǎn)生有著超強抗張強度的蜘蛛絲，很多科學(xué)家把蜘蛛絲叫做“生物鋼”。3940環(huán)境工程菌美國GE公司構(gòu)造成功具有巨大烴類分解能力的工程菌，并獲專利，用于清除石油污染。研究人類遠古的遺傳信息4142第三節(jié)其它生物技術(shù)3.1細胞工程：是指通過細胞水平上的篩選或改造，獲得有商業(yè)價值的細胞株或細胞系，再通過規(guī)模培養(yǎng)，獲得特殊商品的技術(shù)與過程?；驹恚簩⒁环N生物細胞中攜帶全套遺傳信息的基因組或染色體全部轉(zhuǎn)入另一種生物細胞，從而改變細胞的遺傳性，改造生物的性狀和功能。包括細胞融合、細胞器移植、染色體工程、細胞和組培技術(shù)等。43動物細胞培養(yǎng)44體細胞雜交/細胞融合技術(shù)體細胞雜交/細胞融合技術(shù)：通過生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個不同種類的體細胞融合在一起，從而產(chǎn)生具有兩個親本遺傳性狀的新細胞。例如：童魚——世界上第一條沒有父母的魚，“鯽鯉核質(zhì)雜交魚”利用雜交瘤細胞制備單克隆抗體克隆“多莉羊”——細胞融合技術(shù)的高峰473.2蛋白質(zhì)工程“后基因組時代”將是“蛋白質(zhì)組學(xué)時代”，即從對基因信息的研究轉(zhuǎn)向?qū)Φ鞍踪|(zhì)信息的研究，包括研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用及蛋白質(zhì)相互關(guān)系和作用。蛋白質(zhì)工程就是在對蛋白質(zhì)的化學(xué)、晶體學(xué)、動力學(xué)等結(jié)構(gòu)與功能認識的基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化的產(chǎn)品。48蛋白質(zhì)工程的一般過程從生物體中分離純化目的蛋白測定其氨基酸序列借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計各種處理條件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響設(shè)計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。酶催化反應(yīng)動力學(xué)50通過點突變改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)復(fù)性將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)則、無活性的狀態(tài)，恢復(fù)到有唯一立體結(jié)構(gòu)、有生物活性的狀態(tài)的過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。大腸桿菌表達系統(tǒng)效率高、產(chǎn)量大周期短、成本低工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控缺點是易形成包含體。因無法有效的解決復(fù)性問題，在美國每年造成的經(jīng)濟損失就達十億美元

原核與真核細胞表達系統(tǒng)比較原核細胞:發(fā)酵→包含體→復(fù)性→純化→目的蛋白真核細胞:發(fā)酵→上清液→純化→目的蛋白543.3發(fā)酵工程發(fā)酵工程是利用微生物的特性，通過現(xiàn)代工程技術(shù)，生產(chǎn)有用物質(zhì)或直接將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的一門技術(shù)。發(fā)酵工程的基本步驟：包括菌種選育、菌種生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物發(fā)酵和分離以及微生物機能的利用等。優(yōu)點：投資??；見效快；污染小發(fā)酵工程應(yīng)用廣泛：醫(yī)藥工業(yè)；食品工業(yè)；能源工業(yè)；飼料工業(yè)；冶金工業(yè)；農(nóng)業(yè)發(fā)酵工業(yè)回顧幾千年前，人類開始釀酒、制醬、制奶酪等1675年，列文虎克發(fā)明了顯微鏡，觀察到了微生物巴斯德證明酒精發(fā)酵是由于酵母菌引起的，發(fā)酵現(xiàn)象是由微生物所進行的化學(xué)反應(yīng)柯赫建立了單種微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)，新的發(fā)酵產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，以固態(tài)發(fā)酵和淺層液態(tài)發(fā)酵為主上世紀40年代，抗生素大規(guī)模深層發(fā)酵工藝建立隨著新型發(fā)酵設(shè)備、發(fā)酵工藝和育種技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代發(fā)酵工程達到了一個新的高度發(fā)酵工程的內(nèi)容發(fā)酵工程由三部分組成：上游工程、發(fā)酵工程和下游工程上游工程包括優(yōu)良菌種的選育、最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)組成）的確定、營養(yǎng)物的準備等發(fā)酵工程主要指在最適發(fā)酵條件下，在發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。要求嚴格的無菌生長環(huán)境。可分為分批發(fā)酵，補料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵下游工程指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)。包括固液分離技術(shù)，細胞破壁技術(shù)，蛋白質(zhì)純化技術(shù)，和產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)。還要考慮發(fā)酵后的菌體與廢物處理問題發(fā)酵工藝組成部分培養(yǎng)基制備↓種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐→產(chǎn)物的提取精制↑無菌空氣菌種選育發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三個要素：生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和設(shè)備菌種選育的目的是為了改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的需要提高其生產(chǎn)能力能適應(yīng)特定的工藝條件，如能利用廉價的原料、耐受性好目前主要采用自然選育和誘變育種的方法，工作量大，有一定盲目性基因工程、細胞工程等育種方法具有定向性發(fā)酵的基本過程初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的比較發(fā)酵生物反應(yīng)器發(fā)酵罐是最重要的微生物細胞反應(yīng)器染菌率低大型化，有利于提高經(jīng)濟效益過程優(yōu)化可提高產(chǎn)量和降低成本利于提高產(chǎn)品回收率和質(zhì)量生物反應(yīng)器的基本類型攪拌式生物反應(yīng)器（stirredtankreactor）鼓泡塔式反應(yīng)器（bubblecolumn）氣升式反應(yīng)器（airliftreactor）幾種常見的生物反應(yīng)器發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)發(fā)酵過程監(jiān)測物理參數(shù)溫度、壓力、流量、轉(zhuǎn)速、粘度、泡沫位等化學(xué)參數(shù)pH、溶氧、尾氣、發(fā)酵液成分、離子濃度等生物參數(shù)生物量、ATP、蛋白質(zhì)等在線與非在線測量間接測量65本講摘要以重組DNA操作為核心技術(shù)的