分子生物學第三次課3162課件

1.真核生物與原核生物染色體的異同真核生物染色體位于核仁內(nèi)，一般在細胞有絲分裂過程中在光學顯微鏡下可見，而在細胞間期則為染色質(zhì)，間期細胞經(jīng)低滲處理溶脹破裂放出纖維串珠狀的染色質(zhì)。原核生物的染色體位于擬核區(qū)，染色體環(huán)狀位置和形態(tài)：原核生物染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與DAN的折疊、復制、重組及轉(zhuǎn)錄有關(guān)。真核生物DNA和蛋白質(zhì)完全融合在一起，蛋白質(zhì)與DNA的質(zhì)量比為2：1，蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白染色體的倍數(shù)：原核生物染色體一般為單倍體，大多只帶有單拷貝基因每個基因序列幾乎都與它所編碼的蛋白質(zhì)呈線性對應關(guān)系真核生物除性細胞外染色體都是二倍體，每個基因都有2個拷貝DNA與蛋白質(zhì)的關(guān)系2.原核生物基因組原核生物基因組特點：基因連續(xù)，沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)簡練：DNA分子絕大部分用來編碼蛋白質(zhì)，小部分不轉(zhuǎn)錄DNA序列控制基因表達存在轉(zhuǎn)錄單元：原核生物DNA序列中功能相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)基因叢集在基因組的一個或幾個特定的部位，形成功能轉(zhuǎn)錄單元。并被一起轉(zhuǎn)錄為含多個mRNA的分子，叫多順反子mRNA.重疊基因：原核生物中的一些細菌和動物病毒中有重疊基因，即同一段DNA能攜帶兩種不同的蛋白質(zhì)信息。如：ФX174是一種單鏈DNA病毒，含有9個重疊基因，有幾種情況：一個基因完全在另一個基因里，部分重疊，兩個基因只有一個堿基重疊。原核生物基因組具有單個復制起點3.真核生物染色體中的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4非組蛋白組蛋白的特征：進化上極端保守，尤其是H3、H4，沒有組織特異性，僅發(fā)現(xiàn)鳥類兩棲類紅細胞染色體不含H1而帶有H5,精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白。肽鏈上氨基酸分布不對稱，堿性氨基酸分布在N端，疏水基團在C段。組蛋白的修飾作用，包括甲基化，乙?；⒘姿峄?、及糖基化修飾作用發(fā)生在細胞周期的特定時期和組蛋白的特定位點上。MG1G2S組蛋白修飾的生物學意義：乙酰化、甲基化修飾能為相關(guān)調(diào)控蛋白提供附著位點，一般的乙?；苓x擇性使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)從緊密變得松散，開放某些基因轉(zhuǎn)錄，甲基化和可逆磷酸化的調(diào)節(jié)在信號轉(zhuǎn)導過程中有重要的作用，是細胞生命活動的調(diào)控中心4.真核生物基因組DNA真核生物基因組比較大，包括核基因組和細胞器基因組含有大量的重復序列，功能DNA序列大多數(shù)被不編碼非功能DNA隔開使基因組不連續(xù)真核生物的基因為單順反子真核生物基因組有多個復制起點DNA-------核小體--------螺線管----------超螺旋--------染色體11nm30nm300nm1400nm7倍6倍40倍5倍200bp約為68nm染色質(zhì)和核小體DNA和組蛋白有怎樣的關(guān)系？幾個有趣的發(fā)現(xiàn)：染色質(zhì)DNA的Tm值比純DNA高，說明染色質(zhì)中的DNA可能與蛋白質(zhì)分子相互作用染色質(zhì)狀態(tài)下DNA聚合酶和RNA聚合酶催化DNA的復制和轉(zhuǎn)錄低于自由DNA的反應DNA酶1對染色質(zhì)DNA的消化慢于對純DNA的消化染色質(zhì)在電子顯微鏡下為核小體組成的念珠狀結(jié)構(gòu)核酸酶處理染色質(zhì)得到片段的長度均為200bp的倍數(shù)染色體上的非組蛋白：非組蛋白約占組蛋白的60%-70%，種類約有20-100種之間，非組蛋白包括酶類RNA聚合酶及與細胞分裂有關(guān)的酶，核孔復合體蛋白、肌動蛋白等。特性：具有多樣性和異質(zhì)性，不同組織的細胞其種類和數(shù)量都不相同對DNA具有識別特異性，能識別特異DNA序列，識別信息來源于DNA序列本身，識別信息促在于雙螺旋的大溝內(nèi)具有多種動能，參與表達調(diào)控，染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成C值矛盾C值指的是生物單倍體基因組所含的DNA總量C值矛盾是指基因數(shù)量與生物體進化程度不成正比是人類基因組的200倍是人類基因組的12倍生命的特征是什么？生命的特征就是“活的”。生命現(xiàn)象最本質(zhì)的內(nèi)容就是自復制（自我繁殖和自我組織）。一個受精卵為什么變成一朵鮮花或一頭大象？生物的性狀是由什么決定的？又是怎樣代代相傳的呢？人也是從受精卵逐漸發(fā)育成完整的個體的，而決定一個人將來長成什么樣子的生命藍圖就儲存在受精卵的DNA中。DNA（或RNA）攜帶著決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的遺傳信息而且代代相傳，這就我們遺傳信息的傳遞（即復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯）要討論的內(nèi)容。為什么要講復制？就是要了解：子代DNA為什么能真實獲得親代DNA的遺傳信息；復制是怎樣進行的？

第三節(jié)DNA的復制DNA復制可能的幾種方式全保留式半保留式混合式AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT母代DNA子代DNA

按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性,是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。1.半保留復制的含義及意義

當DNA進行復制時，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開成兩條單鏈，各自作為模板合成與之互補的新鏈。在子代DNA雙鏈中，一條是來自于親代，另一條完全重新合成。3.DNA復制的起點方向和速度生物的復制單位稱為復制子。DNA復制由固定起始點開始，從一個DNA復制起點開始最終由這個起點起始的復制叉完成的片段。一個復制子有一個起點，細菌、病毒、線粒體DNA分子都為單個復制子，而真核生物可以同時有多個復制起點以既是說真核生物包含多個復制子復制的起始需要解決兩個問題：DNA解開成單鏈，提供模板生成引物，提供3-OH末端復制時DNA雙鏈解開分成二股單鏈?新鏈沿著張開的二股單鏈生成，復制中形成的這種Y字形的結(jié)構(gòu)稱為復制叉

雙向等速復制為主（2）復制叉（replicationfork)3553新鏈3535親代DNA復制方向真核生物的染色體龐大、復雜，有多個復制起始點，同時進行多個DNA片段的復制。兩個起始點之間的DNA片段，稱為一個復制子（replicon）。真核生物也是雙向等速復制為主。DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結(jié)合到新鏈3’末端，使其不斷延長5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol(4)復制延長的過程dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較性質(zhì)聚合酶I聚合酶II聚合酶III3’-5‘外切5’-3’外切新生鏈合成相對分子量/103細胞內(nèi)分子數(shù)生物學活性++-1034001+--90？0.05+--90010-20155’AGCTTCAGGATA

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’35外切酶活性

53外切酶活性?DNA損傷修復，岡崎片段引物去除能辨認錯配的堿基對，校對作用核酸外切酶活性

前導鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復制是連續(xù)進行的，所得到一條連續(xù)片段的子鏈。5’3’3535解鏈方向復制的半不連續(xù)性3535解鏈方向復制方向與解鏈方向相反，須等待解開足夠長度的模板鏈才能繼續(xù)復制，所得到一條由不連續(xù)片段組成的子鏈。

隨從鏈

(laggingstrand)

岡崎片段（Okazakifragment）

3’5’3’3’5’5`5`5`RNaseHOHP5`DNA聚合酶dNTP5`5`PATPADP+Pi5`5`DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接（5）復制的終止到達終止子序列（Ter）時，Ter-Tue復合物使DnaB不再將DNA解鏈，阻止復制叉遷移。相反方向的復制叉到達后停止復制其間少量未復制序列由修復方式填補拓撲異構(gòu)酶IV作用下復制叉解體，釋放子鏈。真核生物復制的特點真核生物的每條染色體上有多個復制起始點，如酵母17號染色體有400多個起始點，真核生物的染色體在完成復制之前各個起始點的復制不能再開始真核生物復制的起始需要起始原點識別復合物真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

引發(fā)和延伸鏈的功能在復制延長中起主要作用DNA損傷修復中起作用在后隨鏈復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用在線粒體DNA復制中起催化作用DNA-pol

DNA-polDNA-pol

DNA-polDNA的半不連續(xù)復制

拓撲異構(gòu)酶DNA解鏈酶單鏈DNA結(jié)合酶引發(fā)酶DNA聚合酶RnaseH降解酶DNA連接酶DAN復制為半保留復制DAN復制為半不連續(xù)復制DAN復制在特定的起始位點起始，多為雙向等速進行復制1.首先拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋2.DNA解鏈酶解開DNA雙鏈3.單鏈結(jié)合蛋白與DNA單鏈結(jié)合4.引物酶合成引物提供3-OH5.DNA聚合酶合成新鏈，一條鏈為前導鏈，另一條鏈形成岡崎片段6.RNA酶將RNA引物水解，DNA聚合酶將卻空缺按互補配對原則合成DNA,DNA連接酶將DNA連接，形成連續(xù)的新鏈解鏈、解旋酶類

解鏈酶（helicase

)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。

單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）

SSBDnaBDnaC解鏈方向DNA拓撲異構(gòu)酶（DNAtopoiSOmerase）108局部解鏈后引物酶和引發(fā)體引物酶(

primase

)

在模板的復制起始部位催化NTP的聚合,形成短片段的RNA,這一小段RNA作為復制的引物（primer），提供3-OH末端,使DNA-pol能夠催化dNTP聚合。依賴DNA的RNA聚合酶引物酶與其他和復制有關(guān)的蛋白質(zhì)形成的復合物。

引發(fā)體（primosome）DNA復制的特點：1.DNA半保留復制2.半不連續(xù)復制3.需要引物4.雙向復制5.有一定的復制起始點6.DNA復制的保真性與DNA復制有關(guān)的物質(zhì)1.四種脫氧核苷三磷酸2.模板親代DNA解鏈后分別作為模板進行復制3.引物合成酶4.DNA聚合酶5.DNA連接酶6.DNA解旋酶7.單鏈結(jié)合蛋白2.DNA復制的幾種方式(1).線性DNA復制的方式多數(shù)為雙向復制，多個起始位點，復制叉處有眼狀結(jié)構(gòu)，稱為復制眼。(2).環(huán)狀DNA復制方式A.θ復制B.D-環(huán)復制單向復制線粒體，葉綠體C.滾環(huán)復制也叫σ復制

DNA復制的調(diào)控原核生物的調(diào)控，DNA鏈的延伸速度恒定，復制叉的數(shù)量決定細胞生長和增值速度。ColEI質(zhì)粒DNA的復制調(diào)控DNA編碼兩個負調(diào)控因子，Rop蛋白和反義RNADNA復制方向起始點RNA前體100200300400500600-500-400-300-200-100RNA1Rop基因Rop蛋白63個aaRnaseH真核細胞DNA的復制調(diào)控真核細胞的生活周期分為4個時期G1復制預備期S、復制期G2、有絲分裂準備期、M有絲分裂期真核生物復制有3個水平的調(diào)控細胞生活周期水平調(diào)控，決定細胞停留在G1期還是進入S期染色體水平，決定不同染色體或同一染色體不同部位的復制子按一定順序起始復制復制子水平調(diào)控，決定復制的起始與否真核細胞DNA的復制調(diào)控真核細胞的生活周期分為4個時期G1復制預備期、S復制期、G2有絲分裂準備期、M有絲分裂期真核生物復制有3個水平的調(diào)控細胞生活周期水平調(diào)控，決定細胞停留在G1期還是進入S期染色體水平，決定不同染色體或同一染色體不同部位的復制子按一定順序起始復制復制子水平調(diào)控，決定復制的起始與否MG1G2S聚合酶鏈式反應PCR聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術(shù)典型的PCR由（1）高溫變性（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合，兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸

PCR能在（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建。課后復習題：DNA半保留復制DNA的半不連續(xù)復制復制子復制叉如果細菌環(huán)狀染色體的復制是雙向的，并且從固定的復制起點開始，每個復制差以16um/min的速度移動，細菌染色體長1280um,完成整個染色體復制需要多少時間？當細菌在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基每20min分裂一次，也就是說第一輪復制尚未完成就開始第二輪復制，此時染色體有幾個復制叉？課后復習題：DNA半保留復制DNA的半不連續(xù)復制復制子復制叉如果細菌環(huán)狀染色體的復制是雙向的，并且從固定的復制起點開始，每個復制叉以16um/min的速度移動，細菌染色體長1280um,完成整個染色體復制需要多少時間？當細菌在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基每20min分裂一次，也就是說第一輪復制尚未完成就開始第二輪復制，此時染色體有幾個復制叉？DNA損傷的原因及后果電離輻射可見光氧自由基H+烷化劑8-oxoGP/P復制錯誤核苷類似物mCUDNA損傷的后果信號傳導異常長時辰效應老化腫瘤